Summary

النقل بالتبني للبلاعم المحفزة ب IL-33 إلى نماذج الفئران المستحثة بالبليوميسين لدراسة تأثيرها على التليف الرئوي مجهول السبب في الجسم الحي

Published: May 05, 2023
doi:

Summary

يصف هذا البروتوكول عزل الضامة الخلالية الرئوية (IMs) ونقلها بالتبني بعد تحفيز IL-33 للحويصلات الهوائية الرئوية في نموذج الفأر ، والذي يمكن أن يسهل الدراسة في الجسم الحي للتليف الرئوي مجهول السبب (IPF).

Abstract

تعد الاستجابة الالتهابية الناجمة عن إصابة الرئة المبكرة أحد الأسباب المهمة لتطور التليف الرئوي مجهول السبب (IPF) ، والذي يصاحبه تنشيط الخلايا الالتهابية مثل الضامة والعدلات ، بالإضافة إلى إطلاق العوامل الالتهابية بما في ذلك TNF-α و IL-1β و IL-6. من المعروف أن الالتهاب المبكر الناجم عن الضامة الخلالية الرئوية المنشطة (IMs) استجابة لتحفيز IL-33 يلعب دورا حيويا في العملية المرضية ل IPF. يصف هذا البروتوكول النقل بالتبني للرسائل العضلية التي يحفزها IL-33 إلى رئتي الفئران لدراسة تطور IPF. وهو ينطوي على عزل وزراعة الحقن العضلي الأولي من رئتي الفأر المضيف ، يليه النقل بالتبني للرسائل العضلية المحفزة إلى الحويصلات الهوائية للفئران المتلقية IPF التي يسببها بليوميسين (BLM) (والتي تم استنفادها سابقا من البلاعم السنخية عن طريق العلاج بالليبوزومات الشحمية كلودرونات) ، والتقييم المرضي لتلك الفئران. تظهر النتائج التمثيلية أن النقل بالتبني للبلاعم المحفزة IL-33 يؤدي إلى تفاقم التليف الرئوي في الفئران ، مما يشير إلى أن إنشاء تجربة نقل البلاعم بالتبني هو وسيلة تقنية جيدة لدراسة أمراض IPF.

Introduction

التليف الرئوي مجهول السبب (IPF) هو مرض التهابي رئوي منتشر تسببه العديد من العوامل1. في البيئة المكروية السيتوكينية للاستجابة المناعية Th1 و Th2 ، يمكن استقطاب البلاعم إلى بلاعم منشطة بشكل كلاسيكي (M1) وبلاعم نشطة بدلا من ذلك (M2). تحفز عديدات السكاريد الدهنية (LPS) أو السيتوكين IFN- γ الضامة M1 على استقطاب وإنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، بما في ذلك iNOS و IL-1 و IL-6 و TNF-α و IL-12. في المقابل ، فإن السيتوكينات من النوع الثاني IL-4 و IL-13 تقود استقطاب الضامة M2 ، والتي يمكن أن تنتج عوامل مختلفة لتعزيز نمو الخلايا الليفية ، مثل TGF-β و PDGF ، التي تعزز التليف الرئوي2. ويرافق العملية المرضية ل IPF تنشيط البلاعم والتسلل. يتوسط IPF إصلاح الإصابة والالتهاب والتليف من خلال إطلاق السيتوكينات3. نظرا لتوفر خيارات علاجية محدودة فقط ، فإن استكشاف الآليات المرضية الجزيئية ل IPF يحمل أهمية كبيرة لتطوير استراتيجيات جديدة للوقاية من IPF وعلاجه. أكدت الدراسات السابقة التي أجرتها مجموعتنا وباحثون آخرون 4,5 زيادة إطلاق IL-33 في مرضى IPF وفي نماذج الفئران مع بليوميسين (BLM) الناجم عن IPF. يتم إطلاق IL-33 بواسطة الخلايا الظهارية والبطانية أثناء التليف ويشارك في تنشيط البلاعم ، مما يؤدي إلى تكاثر غير طبيعي للخلايا الليفية ، وتسلل الكريات البيض ، وفقدان وظائف الرئة في نهاية المطاف5. يصف البروتوكول الحالي النقل بالتبني للبلاعم الخلالية المحفزة IL-33 (IMs) إلى الحويصلات الهوائية كوسيلة لدراسة تطور IPF في نماذج الفئران. هنا ، تم عزل IMs من أنسجة الرئة للفئران المضيفة ، وزرعت في المختبر ، وحفزت مع IL-33 لمدة 24 ساعة ، ثم نقلها بالتبني إلى الحويصلات الهوائية للفئران المتلقية عن طريق حقن القصبة الهوائية. تم العثور على المجموعة المباشرة من البلاعم الفأر المحفزة ونقلها بالتبني إلى الحويصلات الهوائية المتلقية لتفاقم درجة التليف الرئوي ويمكن أن توضح بشكل أوضح تأثير العوامل المحفزة على التليف مقارنة بالدراسات السابقة6. يمكن للتقنية الموصوفة في هذه الورقة أن تمكن الباحثين من استكشاف وظيفة الضامة التي تحفزها السيتوكينات المحتملة في تطوير IPF.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر. تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات رعاية الحيوان التجريبي بجامعة جيانغنان (JN No. 20211130m1720615 [501]). ملاحظة: في المجموع ، تم استخدام 10 ذكور من الفئران C57BL / 6 الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أساب?…

Representative Results

يتم تلخيص البروتوكول المستخدم هنا في المخطط الانسيابي في الشكل 1. تم استخدام استنشاق الجسيمات الشحمية كلودرونات من خلال الأنف (الشكل 2) لاستنفاد الضامة الرئوية للفئران البالغة C57BL / 6 ، وهذا أنتج نموذجا جيدا للفأر المتلقي. تم عزل العضل الرئوي من فأر آخر (مضيف) …

Discussion

توفر هذه الدراسة طريقة فعالة لاستنفاد البلاعم وعزلها واستزراعها ونقلها ، والتي يمكن أن تساعد في دراسة آليات التليف الرئوي في الفئران. هناك العديد من الطرق لاستنفاد بلاعم الفئران ، مثل إدارة القصبة الهوائية ، وحقن الوريد الذيل ، واستنشاق الأنف11. حسنت هذه الدراسة طريقة استنشا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يقر المؤلفون بالموضوع الخاص لإدارة المختبرات بجامعة جيانغنان: بناء مكتبة شرائح رقمية تعتمد على العينات المرضية (JDSYS202223) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81800065).

Materials

 DMEM Life technologies Biotechnology,USA 1508012
Arterial indwelling needle B Braun Melsingen AG,Germany 21G15G8393
BD Accuri C6 Plus Becton Dickinson,USA
Bleomycin Biotang, USA Ab9465
Carbon dioxide incubator Thermo Forma, USA Thermo Forma370
CD11b R&D Systems,USA 1124F
CD11c R&D Systems,USA N418
Cell culture dish Thermo Forma, USA 174926
Clodronate liposomes  Clodronate liposomes,Netherlands CI-150-150
Collagenase A Sigma-Aldrich, USA 10103578001
F4/80 R&D Systems,USA 521204
Falcon Cell Strainer Becton,Dickinson and Company, USA 352340
Fetal bovine serum (FBS) Life technologies,USA 1047571
Hematoxylin Eosin  Nanjing Jiancheng Technology,China 06-570
LightCycler 480 PCR detection system Roche, USA
Murine recombinant factor IL-33 Peprotech, USA 210-33
Nikon microscope Nikon Corporation, Japan 941185
Penicillin, streptomycin Life technologies,USA 877113
Phosphate buffer (PBS) Guangdong Huankai Microbial Technology ,China 1535882
RBC lysis buffer Beyotime Biotechnology Company,China C3702
RNA Isolater Vazyme company,China R401-01-AA Total RNA extraction reagent
RWD Inhalation Anesthesia Machine Shenzhen Rayward Life Technology ,China R500
Semi-automatic paraffin slicer Leica, Germany LeicaRM2245
SYBR Premix Ex Taq Takara, Japan 410800
Trypsin 0.25% Life Technologies, USA 1627172

References

  1. Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
  2. Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).
  3. Lee, J. W., et al. The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases. Cells. 10 (4), 897 (2021).
  4. Luzina, I. G., et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).
  5. Nie, Y., et al. AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation. Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).
  6. Qian, F., et al. The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation. Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).
  7. Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process. Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).
  8. He, W., et al. Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nature Communications. 8 (1), 846 (2017).
  9. Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats. Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).
  10. Hübner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).
  11. Tacke, F., et al. Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery. The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).
  12. Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).
  13. Wendisch, D., et al. SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis. Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).
  14. Zhang, L., et al. Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis. Respiratory Research. 19 (1), 170 (2018).

Play Video

Cite This Article
Zhai, X., Li, J., Nie, Y. Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo. J. Vis. Exp. (195), e64742, doi:10.3791/64742 (2023).

View Video