Summary

Aislamiento y cuantificación del virus de Epstein-Barr de la línea celular P3HR1

Published: September 28, 2022
doi:

Summary

Este protocolo permite el aislamiento de partículas del virus de Epstein-Barr de la línea celular humana P3HR1 al inducir el ciclo lítico viral con forbol 12-miristato 13-acetato. Posteriormente, el ADN se extrae de la preparación viral y se somete a PCR en tiempo real para cuantificar la concentración de partículas virales.

Abstract

El virus de Epstein-Barr (EBV), formalmente designado como Herpesvirus humano 4 (HHV-4), es el primer virus tumoral humano aislado. Casi el 90-95% de la población adulta del mundo está infectada por EBV. Con los recientes avances en biología molecular e inmunología, la aplicación de modelos experimentales in vitro e in vivo ha proporcionado una visión profunda y significativa de la patogénesis del VEB en muchas enfermedades, así como de la tumorigénesis asociada al VEB. El objetivo de este trabajo de experimento visualizado es proporcionar una visión general del aislamiento de partículas virales de EBV de células de la línea celular P3HR1, seguido de la cuantificación de la preparación viral. Las células P3HR1, originalmente aisladas de un linfoma de Burkitt humano, pueden producir un virus P3HR1, que es una cepa de EBV tipo 2. El ciclo lítico del VEB puede ser inducido en estas células P3HR1 mediante el tratamiento con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), produciendo partículas virales del VEB.

Utilizando este protocolo para el aislamiento de partículas de EBV, las células P3HR1 se cultivan durante 5 días a 37 °C y 5% deCO2 en medio RPMI-1640 completo que contiene 35 ng / ml PMA. Posteriormente, el medio de cultivo se centrifuga a una velocidad de 120 x g durante 8 min para granular las células. El sobrenadante que contiene el virus se recoge y se hace girar a una velocidad de 16.000 x g durante 90 minutos para granular las partículas de EBV. El pellet viral se resuspende en un medio RPMI-1640 completo. Esto es seguido por la extracción de ADN y la PCR cuantitativa en tiempo real para evaluar la concentración de partículas de VEB en la preparación.

Introduction

El virus de Epstein-Barr (VEB) es el primer virus tumoral humano que se ha aislado1. EBV, formalmente conocido como Herpesvirus humano 4 (HHV-4) 2, es parte de la subfamilia de virus del herpes gamma de la familia de virus del herpes y es el prototipo del género Lymphocryptovirus . Casi el 90-95% de la población adulta del mundo está infectada por el virus3. En la mayoría de los casos, la infección inicial ocurre dentro de los primeros 3 años de vida y es asintomática, sin embargo, si la infección ocurre más tarde durante la adolescencia, puede dar lugar a una enfermedad denominada mononucleosis infecciosa4. El VEB es capaz de infectar las células B en reposo induciéndolas a convertirse en linfoblastos B proliferativos en los que el virus establece y mantiene un estado de infección latente5. El VEB puede reactivarse en cualquier momento y, por lo tanto, provocar infecciones recurrentes6.

En los últimos 50 años, la asociación entre algunos virus y el desarrollo de neoplasias malignas humanas se ha vuelto cada vez más evidente, y hoy se estima que entre 15% y 20% de todos los cánceres humanos están relacionados con infecciones virales7. Los virus del herpes, incluido el VEB, son algunos de los ejemplos mejor estudiados de estos tipos de virus tumorales8. De hecho, el VEB puede causar muchos tipos de neoplasias malignas humanas, como el linfoma de Burkitt (BL), el linfoma de Hodgkin (LH), el linfoma difuso de células B grandes y las enfermedades linfoproliferativas en huéspedes inmunocomprometidos 9,10. También se ha demostrado que el VEB está asociado con el desarrollo de enfermedades autoinmunes sistémicas. Algunos ejemplos de estos trastornos autoinmunes son la artritis reumatoide (AR), la polimiositis-dermatomiositis (PM-DM), el lupus eritematoso sistémico (LES), la enfermedad mixta del tejido conectivo (MCTD) y el síndrome de Sjögren (SS)11. El VEB también está asociado con el desarrollo de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII)12.

Muchas de estas enfermedades se pueden estudiar o modelar utilizando cultivos celulares, ratones u otros organismos que están infectados con EBV. Es por ello que se necesitan partículas de VEB para infectar células u organismos, ya sea in vitro o in vivo modelos 13,14,15,16, de ahí la necesidad de desarrollar una técnica que permita el aislamiento de partículas virales a bajo coste. El protocolo descrito aquí proporciona pautas para una manera fácil de aislar de manera confiable las partículas de EBV de una línea celular relativamente accesible y cuantificar las partículas utilizando PCR en tiempo real, que es rentable y fácilmente disponible para la mayoría de los laboratorios. Esto es en comparación con varios otros métodos que se han descrito para aislar el VEB de diferentes líneas celulares17,18,19,20.

P3HR-1 es una línea celular BL que crece en suspensión y está infectada latentemente con una cepa de EBV tipo 2. Esta línea celular es un productor de VEB y puede ser inducida a producir partículas virales. El objetivo de este manuscrito es mostrar un método que permita el aislamiento de partículas de VEB de la línea celular P3HR-1, seguido de la cuantificación del stock viral que luego podría usarse para modelos experimentales de VEB in vitro e in vivo .

Protocol

NOTA: El VEB debe considerarse un material potencialmente peligroso para el uso biológico y, por lo tanto, debe manejarse bajo contención de nivel 2 de bioseguridad o superior. Se debe usar una bata de laboratorio y guantes. Si existe la posibilidad de exposición a salpicaduras, también se debe considerar la protección ocular. El siguiente procedimiento debe llevarse a cabo en un gabinete de seguridad biológica. 1. Contando las celdas P3HR1 Centrifugación y re…

Representative Results

El objetivo de este procedimiento es aislar las partículas de VEB en una suspensión con título viral conocido, que posteriormente podría usarse para modelar la infección por VEB. Por lo tanto, es de suma importancia utilizar concentraciones óptimas de los diferentes reactivos para obtener el mayor rendimiento de EBV del procedimiento. Se realizó un ensayo de optimización para determinar las concentraciones de PMA y DMSO que producirían el mayor número de partículas de EBV (<strong c…

Discussion

La producción de partículas de VEB es necesaria para comprender la biología de este virus, así como sus enfermedades asociadas. Aquí describimos la producción de estas partículas a partir de la línea celular P3HR-1. Esta línea celular no es la única línea productora de VEB; de hecho, las partículas de EBV también se han aislado de las células B95-821,22, así como de la línea celular Raji18,19.<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La financiación para este trabajo fue apoyada por subvenciones a ER del Fondo de Investigación Asmar, el Consejo Nacional Libanés de Investigación Científica (L-CNRS) y el Plan de Práctica Médica (MPP) de la Universidad Americana de Beirut.

Materials

0.2 mL thin-walled PCR tubes Thermo Scientific AB0620 Should be autoclaved before use
0.2-10 µL Microvolume Filter Tips Corning 4807 Should be autoclaved before use
0.5-10 µL Pipette BrandTech 704770
10 mL Disposable Serological Pipette Corning 4488
1000 µL Filtered Pipette Tips QSP TF-112-1000-Q
100-1000 µL Pipette Eppendorf 3123000063
100×20 mm Cuture Plates Sarstedt 83.1802
10-100 µL Pipette BrandTech 704774
15 mL Conical Tubes Corning 430791
200 µL Filtered Pipette Tips QSP TF-108-200-Q
20-200 µL Pipette Eppendorf 3123000055
50 mL Conical Tubes Corning 430828
CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler Bio-Rad 184-1000
DMSO Amresco 0231
DNase/RNase Free Water Zymo Research W1001-1
EBER Primers Macrogen N/A Custom Made Primers
EBV DNA Control (Standards) Vircell MBC065
Ethanol (Laboratory Reagent Grade) Fischer Chemical E/0600DF/17
Fetal Bovine Serum Sigma F9665
Fresco 21 MicroCentrifuge Thermo Scientific 10651805
Glycogen Solution Qiagen 158930
Hemocytometer BOECO BOE 01
Inverted Light Microscope Zeiss Axiovert 25
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5121
Microcentrifuge Tube Costar (Corning) 3621 Should be autoclaved before use
P3HR-1 Cell Line ATCC HTB-62
Penicillin-Streptomycin Solution Biowest L0022
Phenol VWR 20599.297
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139
Pipette Filler Thermo Scientific 9501
Precision Wipes Kimtech 7552
RPMI-1640 Culture Medium Sigma R7388
SL 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004030
Sodium Acetate Riedel-de Haën (Honeywell) 25022
Spectrophotomer DeNovix DS-11
Tris-HCl Sigma T-3253
Trypan Blue Solution Sigma T8154
Water Jacketed CO2 Incubator Thermo Scientific 4121

References

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Cite This Article
Bitar, E. R., Shams Eddin, M. S., Rahal, E. A. Isolation and Quantification of Epstein-Barr Virus from the P3HR1 Cell Line. J. Vis. Exp. (187), e64279, doi:10.3791/64279 (2022).

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