Summary

בידוד וכימות של נגיף אפשטיין-בר מקו תאי P3HR1

Published: September 28, 2022
doi:

Summary

פרוטוקול זה מאפשר בידוד של חלקיקי נגיף אפשטיין-בר מקו תאי P3HR1 אנושיים עם גרימת מחזור ליטי נגיפי עם פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט. דנ”א מופק לאחר מכן מהתכשיר הנגיפי ונתון ל-PCR בזמן אמת כדי לכמת את ריכוז החלקיקים הנגיפיים.

Abstract

נגיף אפשטיין-בר (באנגלית: Epstein-Barr virus או EBV), המוגדר רשמית כנגיף ההרפס האנושי 4 (HHV-4), הוא נגיף הגידול האנושי המבודד הראשון. כמעט 90-95% מהאוכלוסייה הבוגרת בעולם נגועה ב-EBV. עם ההתקדמות האחרונה בביולוגיה מולקולרית ואימונולוגיה, היישום של מודלים ניסיוניים במבחנה וב- in vivo סיפק תובנה עמוקה ומשמעותית על הפתוגנזה של EBV במחלות רבות, כמו גם על גידולים הקשורים ל- EBV. מטרת מאמר ניסוי חזותי זה היא לספק סקירה כללית של בידוד חלקיקים נגיפיים EBV מתאים של קו התאים P3HR1, ולאחר מכן כימות של ההכנה הנגיפית. תאי P3HR1, שבודדו במקור מלימפומה של בורקיט אנושי, יכולים לייצר נגיף P3HR1, שהוא זן EBV מסוג 2. ניתן לשרות את המחזור הליטי של EBV בתאי P3HR1 אלה על ידי טיפול בפורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA), המניב חלקיקים נגיפיים EBV.

באמצעות פרוטוקול זה לבידוד חלקיקי EBV, תאי P3HR1 עוברים תרבית במשך 5 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 בתווך RPMI-1640 שלם המכיל 35 ננוגרם/מ”ל PMA. לאחר מכן, מדיום התרבית הוא צנטריפוגה במהירות של 120 x g במשך 8 דקות כדי לזרוק את התאים. לאחר מכן, הסופר-נאטנט המכיל את הנגיף נאסף ומסתובב מטה במהירות של 16,000 x g למשך 90 דקות כדי לזרוק את חלקיקי ה-EBV. לאחר מכן הכדור הנגיפי עובר החייאה במדיום RPMI-1640 שלם. לאחר מכן מתבצע מיצוי דנ”א ו-PCR כמותי בזמן אמת כדי להעריך את ריכוז חלקיקי ה-EBV בתכשיר.

Introduction

נגיף אפשטיין-בר (EBV) הוא נגיף הגידול האנושי הראשון שבודד1. EBV, המכונה באופן רשמי וירוס ההרפס האנושי 4 (HHV-4)2, הוא חלק מתת-משפחת נגיפי ההרפס גמא של משפחת נגיפי ההרפס והוא אב הטיפוס של הסוג לימפוקריפטווירוס לימפוקריפטווירוס. כמעט 90-95% מהאוכלוסייה הבוגרת בעולם נגועה בנגיף3. ברוב המקרים, זיהום ראשוני מתרחש בתוך 3 השנים הראשונות של החיים והוא אסימפטומטי, עם זאת, אם זיהום מתרחשת מאוחר יותר במהלך גיל ההתבגרות, זה עלול לעורר מחלה המכונה mononucleosis זיהומיות4. EBV מסוגל להדביק תאי B במנוחה ולגרום להם להפוך ללימפובלסטים מסוג B מתרבים שבהם הנגיף מבסס ומתחזק מצב נגוע סמוי5. EBV יכול לפעול מחדש בכל עת ובכך להוביל לזיהומים חוזרים6.

במהלך 50 השנים האחרונות, הקשר בין וירוסים מסוימים לבין התפתחות של ממאירויות אנושיות הפך ברור יותר ויותר, וכיום ההערכה היא כי 15% עד 20% מכלל סוגי הסרטן האנושיים קשורים לזיהומים ויראליים7. נגיפי ההרפס, כולל EBV, הם חלק מהדוגמאות הנחקרות ביותר לסוגים אלה של וירוסים סרטניים8. למעשה, EBV יכול לגרום לסוגים רבים של ממאירויות אנושיות, כגון לימפומה Burkitt (BL), לימפומה הודג’קין (HL), לימפומה מפוזרת של תאי B גדולים, ומחלות לימפופרוליפרטיביות אצל מארחים מדוכאי חיסון 9,10. EBV הוכח גם כקשור להתפתחות מחלות אוטואימוניות מערכתיות. כמה דוגמאות להפרעות אוטואימוניות אלה הן דלקת מפרקים שגרונית (RA), פולימיוסיטיס-דרמטומיוסיטיס (PM-DM), זאבת אדמנתית מערכתית (SLE), מחלת רקמת חיבור מעורבת (MCTD) ותסמונת סיוגרן (SS)11. EBV קשור גם להתפתחות מחלות מעי דלקתיות (IBD)12.

רבות מהמחלות האלה ניתנות למחקר או למודל באמצעות תרבית תאים, עכברים או אורגניזמים אחרים הנגועים ב-EBV. לכן יש צורך בחלקיקי EBV כדי להדביק תאים או אורגניזמים, בין אם במבחנה או במודלים in vivo 13,14,15,16, ומכאן הצורך לפתח טכניקה המאפשרת בידוד של חלקיקים נגיפיים בעלות נמוכה. הפרוטוקול המתואר כאן מספק קווים מנחים לדרך קלה לבודד באופן אמין חלקיקי EBV מקו תאים נגיש יחסית ולכמת את החלקיקים באמצעות PCR בזמן אמת, שהוא חסכוני וזמין לרוב המעבדות. זאת בהשוואה למספר שיטות אחרות שתוארו לבודד EBV מקווי תאים שונים17,18,19,20.

P3HR-1 הוא קו תאי BL שגדל בתרחיף ונגוע באופן סמוי בזן EBV מסוג 2. קו תאים זה הוא יצרן EBV וניתן לגרום לו לייצר חלקיקים נגיפיים. מטרתו של כתב יד זה היא להציג שיטה המאפשרת בידוד של חלקיקי EBV מקו התאים P3HR-1, ולאחר מכן כימות של המלאי הנגיפי שיכול לשמש מאוחר יותר הן למודלים ניסיוניים במבחנה והן ב- in vivo EBV.

Protocol

הערה: EBV צריך להיחשב כחומר בעל פוטנציאל ביולוגי, ולכן יש לטפל בו תחת בלימת Biosafety רמה 2 ומעלה. יש ללבוש מעיל מעבדה כמו גם כפפות. אם קיים פוטנציאל לחשיפה להתזות, יש לשקול גם הגנה על העיניים. ההליך הבא צריך להתבצע בקבינט בטיחות ביולוגית. 1. ספירת תאי P3HR1 צנטריפוגה והחי…

Representative Results

מטרת הליך זה היא לבודד חלקיקי EBV בתרחיף עם טיטר ויראלי ידוע, שיכול לשמש לאחר מכן למודל זיהום EBV. לכן, יש חשיבות עליונה להשתמש בריכוזים אופטימליים של הריאגנטים השונים כדי להשיג את תפוקת ה- EBV הגבוהה ביותר מתוך ההליך. ניסוי אופטימיזציה נערך כדי לקבוע את הריכוזים של PMA ו-DMSO שיניבו …

Discussion

ייצור חלקיקי EBV נחוץ להבנת הביולוגיה של נגיף זה, כמו גם המחלות הקשורות אליו. כאן תיארנו את הייצור של חלקיקים אלה מקו התאים P3HR-1. קו תאים זה אינו הקו היחיד של יצרני EBV; למעשה, חלקיקי EBV בודדו גם מתאי B95-821,22 וכן מקו תאי ראג’י18,19. מחזור …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המימון לעבודה זו נתמך על ידי מענקים למיון מקרן המחקר אסמר, המועצה הלאומית הלבנונית למחקר מדעי (L-CNRS) ותוכנית הפרקטיקה הרפואית (MPP) באוניברסיטה האמריקאית בביירות.

Materials

0.2 mL thin-walled PCR tubes Thermo Scientific AB0620 Should be autoclaved before use
0.2-10 µL Microvolume Filter Tips Corning 4807 Should be autoclaved before use
0.5-10 µL Pipette BrandTech 704770
10 mL Disposable Serological Pipette Corning 4488
1000 µL Filtered Pipette Tips QSP TF-112-1000-Q
100-1000 µL Pipette Eppendorf 3123000063
100×20 mm Cuture Plates Sarstedt 83.1802
10-100 µL Pipette BrandTech 704774
15 mL Conical Tubes Corning 430791
200 µL Filtered Pipette Tips QSP TF-108-200-Q
20-200 µL Pipette Eppendorf 3123000055
50 mL Conical Tubes Corning 430828
CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler Bio-Rad 184-1000
DMSO Amresco 0231
DNase/RNase Free Water Zymo Research W1001-1
EBER Primers Macrogen N/A Custom Made Primers
EBV DNA Control (Standards) Vircell MBC065
Ethanol (Laboratory Reagent Grade) Fischer Chemical E/0600DF/17
Fetal Bovine Serum Sigma F9665
Fresco 21 MicroCentrifuge Thermo Scientific 10651805
Glycogen Solution Qiagen 158930
Hemocytometer BOECO BOE 01
Inverted Light Microscope Zeiss Axiovert 25
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5121
Microcentrifuge Tube Costar (Corning) 3621 Should be autoclaved before use
P3HR-1 Cell Line ATCC HTB-62
Penicillin-Streptomycin Solution Biowest L0022
Phenol VWR 20599.297
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139
Pipette Filler Thermo Scientific 9501
Precision Wipes Kimtech 7552
RPMI-1640 Culture Medium Sigma R7388
SL 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004030
Sodium Acetate Riedel-de Haën (Honeywell) 25022
Spectrophotomer DeNovix DS-11
Tris-HCl Sigma T-3253
Trypan Blue Solution Sigma T8154
Water Jacketed CO2 Incubator Thermo Scientific 4121

References

  1. Epstein, M. A., Achong, B. G., Barr, Y. M. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt’s lymphoma. Lancet. 1 (7335), 702-703 (1964).
  2. Sample, J., et al. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. Journal of Virology. 64 (9), 4084-4092 (1990).
  3. Chang, M. S., Kim, W. H. Epstein-Barr virus in human malignancy: a special reference to Epstein-Barr virus associated gastric carcinoma. Cancer Research and Treatment. 37 (5), 257-267 (2005).
  4. Manet, E., Schwab, M. . Encyclopedia of Cancer. , 1602-1607 (2017).
  5. Babcock, G. J., Decker, L. L., Volk, M., Thorley-Lawson, D. A. EBV persistence in memory B cells in vivo. Immunity. 9 (3), 395-404 (1998).
  6. Khan, G., Miyashita, E. M., Yang, B., Babcock, G. J., Thorley-Lawson, D. A. Is EBV persistence in vivo a model for B cell homeostasis. Immunity. 5 (2), 173-179 (1996).
  7. Jha, H. C., Banerjee, S., Robertson, E. S. The role of gammaherpesviruses in cancer pathogenesis. Pathogens. 5 (1), 18 (2016).
  8. El-Sharkawy, A., Al Zaidan, L., Malki, A. Epstein-Barr virus-associated malignancies: roles of viral oncoproteins in carcinogenesis. Frontiers in Oncology. 8, 265 (2018).
  9. Vereide, D., Sugden, B. Insights into the evolution of lymphomas induced by Epstein-Barr virus. Advances in Cancer Research. 108, 1-19 (2010).
  10. Vereide, D. T., Sugden, B. Lymphomas differ in their dependence on Epstein-Barr virus. Blood. 117 (6), 1977-1985 (2011).
  11. Houen, G., Trier, N. H. Epstein-Barr virus and systemic autoimmune diseases. Frontiers in Immunology. 11, 587380 (2020).
  12. Ortiz, A. N., et al. Impact of Epstein-Barr virus infection on inflammatory bowel disease (IBD) clinical outcomes. Revista Espanola de Enfermedades Digestivas. 114 (5), 259-265 (2021).
  13. Caplazi, P., et al. Mouse models of rheumatoid arthritis. Veterinary Pathology. 52 (5), 819-826 (2015).
  14. Kiesler, P., Fuss, I. J., Strober, W. Experimental models of inflammatory bowel diseases. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 1 (2), 154-170 (2015).
  15. Warde, N. Experimental arthritis: EBV induces arthritis in mice. Nature Reviews Rheumatology. 7 (12), 683 (2011).
  16. Jog, N. R., James, J. A. Epstein Barr virus and autoimmune responses in systemic lupus erythematosus. Frontiers in Immunology. 11, 623944 (2020).
  17. Shimizu, N., Yoshiyama, H., Takada, K. Clonal propagation of Epstein-Barr virus (EBV) recombinants in EBV-negative Akata cells. Journal of Virology. 70 (10), 7260-7263 (1996).
  18. Hsu, C. H., et al. Induction of Epstein-Barr virus (EBV) reactivation in Raji cells by doxorubicin and cisplatin. Anticancer Research. 22, 4065-4071 (2002).
  19. Nutter, L. M., Grill, S. P., Li, J. S., Tan, R. S., Cheng, Y. C. Induction of virus enzymes by phorbol esters and n-butyrate in Epstein-Barr virus genome-carrying Raji cells. Cancer Research. 47 (16), 4407-4412 (1987).
  20. Fresen, K. O., Cho, M. S., zur Hausen, H. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
  21. Glaser, R., Tarr, K. L., Dangel, A. W. The transforming prototype of Epstein-Barr virus (B95-8) is also a lytic virus. International Journal of Cancer. 44 (1), 95-100 (1989).
  22. Sairenji, T., et al. Inhibition of Epstein-Barr virus (EBV) release from P3HR-1 and B95-8 cell lines by monoclonal antibodies to EBV membrane antigen gp350/220. Journal of Virology. 62 (8), 2614-2621 (1988).
  23. Savage, A., et al. An assessment of the population of cotton-top tamarins (Saguinus oedipus) and their habitat in Colombia. PLoS one. 11 (12), 0168324 (2016).
  24. Kallin, B., Klein, G. Epstein-Barr virus carried by raji cells: a mutant in early functions. Intervirology. 19 (1), 47-51 (1983).
  25. Fresen, K. O., Cho, M. S., Hausen, H. Z. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
  26. Bounaadja, L., Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Evaluation of Epstein-Barr virus, human herpesvirus 6 (HHV-6), and HHV-8 antiviral drug susceptibilities by use of real-time-PCR-based assays. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1244-1246 (2013).
  27. Buelow, D., et al. Comparative evaluation of four real-time PCR methods for the quantitative detection of Epstein-Barr virus from whole blood specimens. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (4), 527-534 (2016).
  28. Wu, D. Y., Kalpana, G. V., Goff, S. P., Schubach, W. H. Epstein-Barr virus nuclear protein 2 (EBNA2) binds to a component of the human SNF-SWI complex, hSNF5/Ini1. Journal of Virology. 70 (9), 6020-6028 (1996).
  29. Li, C., et al. EBNA2-deleted Epstein-Barr virus (EBV) isolate, P3HR1, causes Hodgkin-like lymphomas and diffuse large B cell lymphomas with type II and Wp-restricted latency types in humanized mice. PLoS Pathogens. 16 (6), 1008590 (2020).

Play Video

Cite This Article
Bitar, E. R., Shams Eddin, M. S., Rahal, E. A. Isolation and Quantification of Epstein-Barr Virus from the P3HR1 Cell Line. J. Vis. Exp. (187), e64279, doi:10.3791/64279 (2022).

View Video