Summary

Isolierung und Quantifizierung des Epstein-Barr-Virus aus der P3HR1-Zelllinie

Published: September 28, 2022
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Summary

Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung von Epstein-Barr-Viruspartikeln aus der menschlichen P3HR1-Zelllinie nach Induktion des viralen lytischen Zyklus mit Phorbol-12-Myristat-13-acetat. Anschließend wird DNA aus der viralen Zubereitung extrahiert und einer Real-Time-PCR unterzogen, um die Viruspartikelkonzentration zu quantifizieren.

Abstract

Das Epstein-Barr-Virus (EBV), offiziell als Humanes Herpesvirus 4 (HHV-4) bezeichnet, ist das erste isolierte humane Tumorvirus. Fast 90-95% der erwachsenen Weltbevölkerung sind mit EBV infiziert. Mit den jüngsten Fortschritten in der Molekularbiologie und Immunologie hat die Anwendung von experimentellen In-vitro – und In-vivo-Modellen tiefe und aussagekräftige Einblicke in die Pathogenese von EBV bei vielen Krankheiten sowie in die EBV-assoziierte Tumorgenese ermöglicht. Ziel dieser visualisierten Experimentierarbeit ist es, einen Überblick über die Isolierung von EBV-Viruspartikeln aus Zellen der P3HR1-Zelllinie zu geben, gefolgt von einer Quantifizierung der viralen Zubereitung. P3HR1-Zellen, die ursprünglich aus einem menschlichen Burkitt-Lymphom isoliert wurden, können ein P3HR1-Virus produzieren, das ein EBV-Stamm vom Typ 2 ist. Der EBV-lytische Zyklus kann in diesen P3HR1-Zellen durch Behandlung mit Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) induziert werden, wodurch EBV-Viruspartikel entstehen.

Unter Verwendung dieses Protokolls zur Isolierung von EBV-Partikeln werden P3HR1-Zellen für 5 Tage bei 37 °C und 5%CO2 in vollständigem RPMI-1640-Medium kultiviert, das 35 ng/ml PMA enthält. Anschließend wird das Kulturmedium mit einer Geschwindigkeit von 120 x g für 8 min zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Der virushaltige Überstand wird dann gesammelt und mit einer Geschwindigkeit von 16.000 x g für 90 min heruntergeschleudert, um die EBV-Partikel zu pelletieren. Das virale Pellet wird dann in einem vollständigen RPMI-1640-Medium resuspendiert. Es folgen DNA-Extraktion und quantitative real-time PCR, um die Konzentration von EBV-Partikeln in der Zubereitung zu bestimmen.

Introduction

Das Epstein-Barr-Virus (EBV) ist das erste humane Tumorvirus, das isoliert wurde1. EBV, offiziell als Humanes Herpesvirus 4 (HHV-4)2 bezeichnet, ist Teil der Gamma-Herpesvirus-Unterfamilie der Herpesvirusfamilie und ist der Prototyp der Lymphocryptovirus-Gattung. Fast 90-95% der erwachsenen Weltbevölkerung sind mit dem Virus infiziert3. In den meisten Fällen tritt die Erstinfektion innerhalb der ersten 3 Lebensjahre auf und ist asymptomatisch, wenn die Infektion jedoch später während der Adoleszenz auftritt, kann dies zu einer Krankheit führen, die als infektiöse Mononukleosebezeichnet wird 4. EBV ist in der Lage, ruhende B-Zellen zu infizieren, wodurch sie zu proliferativen B-Lymphoblasten werden, in denen das Virus einen latent infizierten Zustand aufbaut und aufrechterhält5. EBV kann jederzeit reaktiviert werden und so zu wiederkehrenden Infektionen führen6.

In den letzten 50 Jahren ist der Zusammenhang zwischen einigen Viren und der Entwicklung menschlicher Malignome immer deutlicher geworden, und heute wird geschätzt, dass 15% bis 20% aller menschlichen Krebserkrankungen mit Virusinfektionen zusammenhängen7. Die Herpesviren, einschließlich EBV, sind einige der am besten untersuchten Beispiele für diese Art von Tumorviren8. Tatsächlich kann EBV viele Arten von menschlichen Malignomen verursachen, wie Burkitt-Lymphom (BL), Hodgkin-Lymphom (HL), diffuses großzelliges B-Zell-Lymphom und lymphoproliferative Erkrankungen in immungeschwächten Wirten 9,10. Es wurde auch gezeigt, dass EBV mit der Entwicklung systemischer Autoimmunerkrankungen assoziiert ist. Einige Beispiele für diese Autoimmunerkrankungen sind rheumatoide Arthritis (RA), Polymyositis-Dermatomyositis (PM-DM), systemischer Lupus erythematodes (SLE), gemischte Bindegewebserkrankung (MCTD) und Sjögren-Syndrom (SS)11. EBV ist auch mit der Entwicklung von entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) verbunden12.

Viele dieser Krankheiten können mit Zellkulturen, Mäusen oder anderen Organismen, die mit EBV infiziert sind, untersucht oder modelliert werden. Aus diesem Grund werden EBV-Partikel benötigt, um Zellen oder Organismen zu infizieren, sei es in vitro oder in vivo Modellen13,14,15,16, daher die Notwendigkeit, eine Technik zu entwickeln, die die Isolierung von Viruspartikeln zu niedrigen Kosten ermöglicht. Das hier beschriebene Protokoll bietet Richtlinien für eine einfache Möglichkeit, EBV-Partikel zuverlässig aus einer relativ zugänglichen Zelllinie zu isolieren und die Partikel mittels real-time PCR zu quantifizieren, die kostengünstig und für die meisten Labore leicht verfügbar ist. Dies steht im Vergleich zu mehreren anderen Methoden, die beschrieben wurden, um EBV aus verschiedenen Zelllinien zu isolieren17,18,19,20.

P3HR-1 ist eine BL-Zelllinie, die in Suspension wächst und latent mit einem EBV-Typ-2-Stamm infiziert ist. Diese Zelllinie ist ein EBV-Produzent und kann dazu gebracht werden, virale Partikel zu produzieren. Das Ziel dieses Manuskripts ist es, eine Methode zu demonstrieren, die die Isolierung von EBV-Partikeln aus der P3HR-1-Zelllinie ermöglicht, gefolgt von einer Quantifizierung des Virusbestands, die später sowohl für in vitro als auch in vivo EBV-Versuchsmodelle verwendet werden könnte.

Protocol

HINWEIS: EBV sollte als potenziell biogefährliches Material betrachtet werden und daher unter der Eindämmung der Biosicherheitsstufe 2 oder höher behandelt werden. Ein Laborkittel sowie Handschuhe sollten getragen werden. Wenn eine mögliche Exposition gegenüber Spritzern besteht, sollte auch ein Augenschutz in Betracht gezogen werden. Das folgende Verfahren sollte in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden. 1. Zählen der P3HR1-Zellen Zentrif…

Representative Results

Ziel dieses Verfahrens ist es, EBV-Partikel in einer Suspension mit bekanntem Virustiter zu isolieren, die anschließend zur Modellierung der EBV-Infektion verwendet werden könnten. Daher ist es von größter Bedeutung, optimale Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien zu verwenden, um die höchste EBV-Ausbeute aus dem Verfahren zu erzielen. Ein Optimierungsversuch wurde durchgeführt, um die Konzentrationen von PMA und DMSO zu bestimmen, die die höchste Anzahl von EBV-Partikeln ergeben …

Discussion

Die Produktion von EBV-Partikeln ist notwendig, um die Biologie dieses Virus sowie die damit verbundenen Krankheiten zu verstehen. Hier haben wir die Herstellung dieser Partikel aus der P3HR-1-Zelllinie beschrieben. Diese Zelllinie ist nicht die einzige EBV-Produktionslinie; Tatsächlich wurden EBV-Partikel auch aus B95-8-Zellen21,22 sowie der Raji-Zelllinie18,19 isoliert. Der EBV-lytische Zyklus wurde in…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Finanzierung dieser Arbeit wurde durch Zuschüsse des Asmar Research Fund, des Lebanese National Council for Scientific Research (L-CNRS) und des Medical Practice Plan (MPP) an der American University of Beirut unterstützt.

Materials

0.2 mL thin-walled PCR tubes Thermo Scientific AB0620 Should be autoclaved before use
0.2-10 µL Microvolume Filter Tips Corning 4807 Should be autoclaved before use
0.5-10 µL Pipette BrandTech 704770
10 mL Disposable Serological Pipette Corning 4488
1000 µL Filtered Pipette Tips QSP TF-112-1000-Q
100-1000 µL Pipette Eppendorf 3123000063
100×20 mm Cuture Plates Sarstedt 83.1802
10-100 µL Pipette BrandTech 704774
15 mL Conical Tubes Corning 430791
200 µL Filtered Pipette Tips QSP TF-108-200-Q
20-200 µL Pipette Eppendorf 3123000055
50 mL Conical Tubes Corning 430828
CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler Bio-Rad 184-1000
DMSO Amresco 0231
DNase/RNase Free Water Zymo Research W1001-1
EBER Primers Macrogen N/A Custom Made Primers
EBV DNA Control (Standards) Vircell MBC065
Ethanol (Laboratory Reagent Grade) Fischer Chemical E/0600DF/17
Fetal Bovine Serum Sigma F9665
Fresco 21 MicroCentrifuge Thermo Scientific 10651805
Glycogen Solution Qiagen 158930
Hemocytometer BOECO BOE 01
Inverted Light Microscope Zeiss Axiovert 25
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5121
Microcentrifuge Tube Costar (Corning) 3621 Should be autoclaved before use
P3HR-1 Cell Line ATCC HTB-62
Penicillin-Streptomycin Solution Biowest L0022
Phenol VWR 20599.297
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139
Pipette Filler Thermo Scientific 9501
Precision Wipes Kimtech 7552
RPMI-1640 Culture Medium Sigma R7388
SL 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004030
Sodium Acetate Riedel-de Haën (Honeywell) 25022
Spectrophotomer DeNovix DS-11
Tris-HCl Sigma T-3253
Trypan Blue Solution Sigma T8154
Water Jacketed CO2 Incubator Thermo Scientific 4121

References

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Bitar, E. R., Shams Eddin, M. S., Rahal, E. A. Isolation and Quantification of Epstein-Barr Virus from the P3HR1 Cell Line. J. Vis. Exp. (187), e64279, doi:10.3791/64279 (2022).

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