P3HR1細胞株からのエプスタインバーウイルスの単離と定量

Summary

このプロトコルは、ホルボール12-ミリステート13-アセテートでウイルス溶解サイクルを誘導する際に、ヒトP3HR1細胞株からエプスタインバーウイルス粒子を単離することを可能にします。続いて、ウイルス調製物からDNAを抽出し、リアルタイムPCRに供してウイルス粒子濃度を定量化する。

Abstract

正式に はヒトヘルペスウイルス4 (HHV-4)と指定されたエプスタインバーウイルス(EBV)は、最初に単離されたヒト腫瘍ウイルスです。世界の成人人口のほぼ90〜95%がEBVに感染しています。分子生物学と免疫学の最近の進歩に伴い、in vitro および in vivo の両方の実験モデルの適用により、多くの疾患におけるEBVの病因およびEBV関連の腫瘍形成に関する深く有意義な洞察が得られました。この視覚化された実験論文の目的は、P3HR1細胞株の細胞からのEBVウイルス粒子の単離の概要を提供し、続いてウイルス調製物を定量することです。もともとヒトバーキットリンパ腫から単離されたP3HR1細胞は、2型EBV株であるP3HR1ウイルスを産生することができる。EBV溶解サイクルは、ホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)で処理することにより、これらのP3HR1細胞において誘導され、EBVウイルス粒子を生じる。

EBV粒子の単離にこのプロトコルを使用して、P3HR1細胞を35 ng/mL PMAを含む完全なRPMI-1640培地で37°Cおよび5%_CO2 で5日間培養します。続いて、培養液を120 x g の速度で8分間遠心分離し、細胞をペレット化します。次に、ウイルスを含む上清を収集し、16,000 x g の速度で90分間スピンダウンして、EBV粒子をペレット化します。次いで、ウイルスペレットを完全なRPMI-1640培地に再懸濁する。これに続いて、DNA抽出と定量的リアルタイムPCRを行い、調製物中のEBV粒子の濃度を評価します。

Introduction

エプスタインバーウイルス(EBV)は、単離された最初のヒト腫瘍ウイルスです¹。正式には ヒトヘルペスウイルス4 (HHV-4)²と呼ばれるEBVは、ヘルペスウイルスファミリーのガンマヘルペスウイルスサブファミリーの一部であり、 リンフォクリプトウイルス 属のプロトタイプです。世界の成人人口のほぼ90〜95%がウイルスに感染しています³。ほとんどの場合、最初の感染は生後3年以内に発生し、無症候性ですが、青年期に感染が後期に発生すると、感染性単核球症と呼ばれる病気を引き起こす可能性があります⁴。EBVは、休止中のB細胞に感染して増殖性Bリンパ芽球になり、ウイルスが潜伏感染状態を確立し維持することができます⁵。EBVはいつでも再活性化する可能性があるため、再発性感染症につながる可能性があります⁶。

過去50年間で、一部のウイルスとヒト悪性腫瘍の発症との関連がますます明らかになり、今日では、すべてのヒト癌の15%から20%がウイルス感染に関連していると推定されています⁷。EBVを含むヘルペスウイルスは、これらのタイプの腫瘍ウイルスの最も研究された例のいくつかです⁸。実際、EBVは、バーキットリンパ腫(BL)、ホジキンリンパ腫(HL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、および免疫不全宿主におけるリンパ増殖性疾患など、多くの種類のヒト悪性腫瘍を引き起こす可能性があります^9,10。EBVはまた、全身性自己免疫疾患の発症と関連していることが示されている。これらの自己免疫疾患の例としては、関節リウマチ(RA)、多発性筋炎皮膚筋炎(PM-DM)、全身性エリテマトーデス(SLE)、混合結合組織疾患(MCTD)、シェーグレン症候群(SS)^{などがあります11}。EBVは炎症性腸疾患(IBD)¹²の発症にも関連しています。

これらの疾患の多くは、細胞培養、マウス、またはEBVに感染した他の生物を使用して研究またはモデル化することができます。そのため、in vitroまたはin vivoモデル^13,14,15,16にかかわらず、細胞または生物に感染するためにEBV粒子が必要であり、したがって、低コストでウイルス粒子を単離できる技術を開発する必要があります。ここで説明するプロトコルは、比較的アクセスしやすい細胞株からEBV粒子を確実に分離し、費用対効果が高く、ほとんどのラボですぐに利用できるリアルタイムPCRを使用して粒子を定量する簡単な方法のガイドラインを提供します。これは、異なる細胞株からEBVを単離するために記載されているいくつかの他の方法と比較した^{ものである17}、^18、19、20。

P3HR-1は、浮遊状態で増殖し、EBV2型株に潜伏感染するBL細胞株です。この細胞株はEBV産生剤であり、ウイルス粒子を産生するように誘導することができる。この原稿の目的は、P3HR-1細胞株からEBV粒子を単離し、その後、 in vitro および in vivo の両方のEBV実験モデルに使用できるウイルスストックを定量する方法を紹介することです。

Protocol

注:EBVは潜在的にバイオハザード物質と見なされる必要があるため、バイオセーフティレベル2以上の封じ込めの下で取り扱う必要があります。白衣と手袋を着用する必要があります。水しぶきにさらされる可能性がある場合は、目の保護も考慮する必要があります。以下の手順は、生物学的安全キャビネットで実施する必要があります。 1. P3HR1細胞のカウント<…

Representative Results

この手順の目的は、既知のウイルス力価を有する懸濁液中のEBV粒子を単離することであり、その後EBV感染をモデル化するために使用することができる。したがって、手順から最高のEBV収率を得るために、さまざまな試薬の最適濃度を使用することが最も重要です。 最も多くのEBV粒子を生成するPMAおよびDMSOの濃度を決定するために、最適化試験が実施されました(<strong clas…

Discussion

EBV粒子の生産は、このウイルスの生物学とそれに関連する病気を理解するために必要です。ここでP3HR-1細胞株からのこれらの粒子の産生について記載した。この細胞株は唯一のEBV産生株ではありません。実際、EBV粒子は、B95-8細胞^21,22ならびにRaji細胞株^18,19からも単離されている。EBV溶解サイクルは、n-酪…

Materials

0.2 mL thin-walled PCR tubes	Thermo Scientific	AB0620	Should be autoclaved before use
0.2-10 µL Microvolume Filter Tips	Corning	4807	Should be autoclaved before use
0.5-10 µL Pipette	BrandTech	704770
10 mL Disposable Serological Pipette	Corning	4488
1000 µL Filtered Pipette Tips	QSP	TF-112-1000-Q
100-1000 µL Pipette	Eppendorf	3123000063
100×20 mm Cuture Plates	Sarstedt	83.1802
10-100 µL Pipette	BrandTech	704774
15 mL Conical Tubes	Corning	430791
200 µL Filtered Pipette Tips	QSP	TF-108-200-Q
20-200 µL Pipette	Eppendorf	3123000055
50 mL Conical Tubes	Corning	430828
CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler	Bio-Rad	184-1000
DMSO	Amresco	0231
DNase/RNase Free Water	Zymo Research	W1001-1
EBER Primers	Macrogen	N/A	Custom Made Primers
EBV DNA Control (Standards)	Vircell	MBC065
Ethanol (Laboratory Reagent Grade)	Fischer Chemical	E/0600DF/17
Fetal Bovine Serum	Sigma	F9665
Fresco 21 MicroCentrifuge	Thermo Scientific	10651805
Glycogen Solution	Qiagen	158930
Hemocytometer	BOECO	BOE 01
Inverted Light Microscope	Zeiss	Axiovert 25
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
Microcentrifuge Tube	Costar (Corning)	3621	Should be autoclaved before use
P3HR-1 Cell Line	ATCC	HTB-62
Penicillin-Streptomycin Solution	Biowest	L0022
Phenol	VWR	20599.297
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Pipette Filler	Thermo Scientific	9501
Precision Wipes	Kimtech	7552
RPMI-1640 Culture Medium	Sigma	R7388
SL 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004030
Sodium Acetate	Riedel-de Haën (Honeywell)	25022
Spectrophotomer	DeNovix	DS-11
Tris-HCl	Sigma	T-3253
Trypan Blue Solution	Sigma	T8154
Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Scientific	4121