该协议允许在用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯诱导病毒裂解循环时从人P3HR1细胞系中分离Epstein-Barr病毒颗粒。随后从病毒制剂中提取DNA,并进行实时PCR以量化病毒颗粒浓度。
爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV),正式名称为 人类疱疹病毒4 (HHV-4),是第一个分离的人类肿瘤病毒。世界上近90-95%的成年人口感染了EB病毒。随着分子生物学和免疫学的最新进展, 体外 和 体内 实验模型的应用为EBV在许多疾病的发病机制以及EBV相关的肿瘤发生提供了深刻而有意义的见解。这篇可视化实验论文的目的是概述从P3HR1细胞系细胞中分离EBV病毒颗粒,然后对病毒制剂进行定量。P3HR1细胞最初是从人伯基特淋巴瘤中分离出来的,可以产生P3HR1病毒,这是一种2型EBV毒株。通过用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)处理,可以在这些P3HR1细胞中诱导EBV裂解循环,产生EBV病毒颗粒。
使用该协议分离EBV颗粒,将P3HR1细胞在含有35ng / mL PMA的完整RPMI-1640培养基中在37°C和5%CO2 下培养5天。随后,将培养基以120× g 的速度离心8分钟以沉淀细胞。然后收集含病毒的上清液并以16,000× g 的速度旋转90分钟以沉淀EBV颗粒。然后将病毒沉淀重悬于完整的RPMI-1640培养基中。随后进行DNA提取和定量实时PCR,以评估制剂中EBV颗粒的浓度。
EB病毒(EBV)是第一个被分离出来的人类肿瘤病毒1。EB病毒,正式名称为 人类疱疹病毒4 (HHV-4)2,是疱疹病毒家族的γ疱疹病毒亚科的一部分,是 淋巴密码病毒 属的原型。世界上近90-95%的成年人口感染了该病毒3。在大多数情况下,初始感染发生在生命的前 3 年内并且是无症状的,但是,如果感染发生在青春期后期,则可能会引起称为传染性单核细胞增多症的疾病4。EBV能够感染静息的B细胞,诱导它们成为增殖的B淋巴母细胞,其中病毒建立并维持潜伏感染状态5。EB病毒可以随时重新激活,从而导致复发性感染6。
在过去的50年中,某些病毒与人类恶性肿瘤发展之间的关联变得越来越明显,今天估计所有人类癌症中有15%至20%与病毒感染有关7。疱疹病毒,包括EB病毒,是这些类型肿瘤病毒中研究得最好的例子8。事实上,EBV可引起多种类型的人类恶性肿瘤,如伯基特淋巴瘤(BL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤和免疫功能低下的宿主的淋巴组织增生性疾病9,10。EB病毒也被证明与系统性自身免疫性疾病的发展有关。这些自身免疫性疾病的一些例子是类风湿性关节炎 (RA)、多发性肌炎-皮肌炎 (PM-DM)、系统性红斑狼疮 (SLE)、混合性结缔组织病 (MCTD) 和干燥综合征 (SS)11。EB病毒也与炎症性肠病(IBD)的发展有关12。
许多这些疾病可以使用细胞培养物,小鼠或其他感染EBV的生物体进行研究或建模。这就是为什么需要EBV颗粒来感染细胞或生物体,无论是体外还是体内模型13,14,15,16,因此需要开发一种能够以低成本分离病毒颗粒的技术。此处描述的方案提供了一种简单的方法,可以从相对容易获得的细胞系中可靠地分离EBV颗粒,并使用实时荧光定量PCR对颗粒进行定量,这是经济高效的,并且大多数实验室都可以轻松获得。这是与已经描述的从不同细胞系中分离EBV的其他几种方法相比17,18,19,20。
P3HR-1是一种在悬浮液中生长并潜伏感染EBV 2型菌株的BL细胞系。该细胞系是EBV生产者,可以诱导产生病毒颗粒。本手稿的目的是展示一种允许从P3HR-1细胞系中分离EBV颗粒的方法,然后对病毒储液进行定量,以后可用于 体外 和 体内 EBV实验模型。
EBV颗粒的产生对于了解该病毒的生物学及其相关疾病是必要的。在这里,我们描述了从P3HR-1细胞系中产生这些颗粒的过程。该细胞系不是唯一的EBV生产者系;事实上,EBV颗粒也已从B95-8细胞21,22以及Raji细胞系18,19中分离出来。EBV裂解循环已在这些细胞中用正丁酸盐诱导。或者,可以使用佛波醇酯,例如12-O-十?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作的资金得到了阿斯马尔研究基金、黎巴嫩国家科学研究委员会(L-CNRS)和贝鲁特美国大学医疗实践计划(MPP)对ER的赠款的支持。
0.2 mL thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | AB0620 | Should be autoclaved before use |
0.2-10 µL Microvolume Filter Tips | Corning | 4807 | Should be autoclaved before use |
0.5-10 µL Pipette | BrandTech | 704770 | |
10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4488 | |
1000 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-112-1000-Q | |
100-1000 µL Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
100×20 mm Cuture Plates | Sarstedt | 83.1802 | |
10-100 µL Pipette | BrandTech | 704774 | |
15 mL Conical Tubes | Corning | 430791 | |
200 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-108-200-Q | |
20-200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
50 mL Conical Tubes | Corning | 430828 | |
CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 184-1000 | |
DMSO | Amresco | 0231 | |
DNase/RNase Free Water | Zymo Research | W1001-1 | |
EBER Primers | Macrogen | N/A | Custom Made Primers |
EBV DNA Control (Standards) | Vircell | MBC065 | |
Ethanol (Laboratory Reagent Grade) | Fischer Chemical | E/0600DF/17 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F9665 | |
Fresco 21 MicroCentrifuge | Thermo Scientific | 10651805 | |
Glycogen Solution | Qiagen | 158930 | |
Hemocytometer | BOECO | BOE 01 | |
Inverted Light Microscope | Zeiss | Axiovert 25 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
Microcentrifuge Tube | Costar (Corning) | 3621 | Should be autoclaved before use |
P3HR-1 Cell Line | ATCC | HTB-62 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biowest | L0022 | |
Phenol | VWR | 20599.297 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Pipette Filler | Thermo Scientific | 9501 | |
Precision Wipes | Kimtech | 7552 | |
RPMI-1640 Culture Medium | Sigma | R7388 | |
SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | |
Sodium Acetate | Riedel-de Haën (Honeywell) | 25022 | |
Spectrophotomer | DeNovix | DS-11 | |
Tris-HCl | Sigma | T-3253 | |
Trypan Blue Solution | Sigma | T8154 | |
Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4121 |