Plataforma analítica multimodal en un chip de resonancia de plasmón de superficie multiplexada para el análisis de subconjuntos de vesículas extracelulares
Summary
Este artículo propone una nueva generación de plataformas analíticas multiparamétricas con mayor rendimiento para la caracterización de subconjuntos de vesículas extracelulares. El método se basa en una combinación de métodos de biodetección multiplexada con análisis metrológicos y morfomecánicos por microscopía de fuerza atómica, junto con espectroscopia Raman, para calificar objetivos vesiculares atrapados en un biochip de microarray.
Abstract
Las vesículas extracelulares (EV) son pequeñas vesículas derivadas de membrana producidas por todas las células que van desde 50 a varios cientos de nanómetros de diámetro y se utilizan como medio de comunicación intercelular. Están emergiendo como herramientas diagnósticas y terapéuticas prometedoras para una variedad de enfermedades. Hay dos procesos principales de biogénesis utilizados por las células para producir EV con diferencias en tamaño, composición y contenido. Debido a su alta complejidad en tamaño, composición y origen celular, su caracterización requiere una combinación de técnicas analíticas. Este proyecto implica el desarrollo de una nueva generación de plataformas analíticas multiparamétricas con mayor rendimiento para la caracterización de subpoblaciones de vehículos eléctricos. Para lograr este objetivo, el trabajo parte de la plataforma nanobioanalítica (NBA) establecida por el grupo, que permite una investigación original de EVs basada en una combinación de métodos de biodetección multiplexados con análisis metrológicos y morfomecánicos por microscopía de fuerza atómica (AFM) de objetivos vesiculares atrapados en un biochip de microarray. El objetivo era completar esta investigación EV con un análisis fenotípico y molecular mediante espectroscopia Raman. Estos desarrollos permiten proponer una solución analítica multimodal y fácil de usar para la discriminación de subconjuntos EV en fluidos biológicos con potencial clínico.
Introduction
El creciente interés en la investigación de EV en el diagnóstico y en la terapéutica 1,2,3,4,5, combinado con los desafíos que enfrenta este campo, ha resultado en el desarrollo e implementación de una gran variedad de enfoques y técnicas para cuantificar o caracterizar estas vesículas. Los métodos más utilizados para la identificación de EV son la inmunotransferencia específica de proteínas y la proteómica para confirmar el origen de las EV, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) para confirmar su estructura y el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) para cuantificar su número y distribución de tamaño en un volumen de muestra.
Sin embargo, ninguna de estas técnicas por sí sola proporciona toda la información requerida para caracterizar los subconjuntos de EV. La heterogeneidad inherente de los EV debido a la diversidad en sus propiedades bioquímicas y físicas impide los análisis globales que son confiables y reproducibles, especialmente para los EV contenidos en una mezcla (muestra cruda). Por lo tanto, los métodos de detección y caracterización son necesarios para los VE, tanto individualmente como en general para complementar otros métodos que son más rápidos pero no selectivos6.
La imagen de alta resolución por TEM (o cryoTEM) o AFM permite la determinación de la morfología y metrología de EVs con una resolución nanométrica 7,8,9,10,11,12. Sin embargo, la principal limitación del uso de la microscopía electrónica para objetos biológicos, como los EV, es la necesidad de un vacío para llevar a cabo el estudio que requiere la fijación y deshidratación de la muestra. Tal preparación hace que sea difícil de traducir de las estructuras observadas a la morfología EV en solución. Para evitar esta deshidratación de la muestra, la técnica de crioTEM es la más adecuada para la caracterización de EV13. Es ampliamente utilizado para determinar la ultraestructura de los vehículos eléctricos. El inmunomarcaje de vesículas mediante nanopartículas de oro biofuncionalizadas también permite identificar subpoblaciones específicas de EV y distinguirlas de otras partículas presentes en una muestra biológica compleja. Sin embargo, debido al bajo número de EV analizadas por microscopía electrónica, a menudo es difícil realizar una caracterización que sea representativa de una muestra compleja y heterogénea.
Para revelar esta heterogeneidad de tamaño, la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV) sugiere analizar un número suficiente de imágenes de campo amplio, acompañadas de imágenes más pequeñas, para revelar EV individuales con alta resolución14. AFM es una alternativa a los enfoques ópticos y las técnicas de difracción electrónica para el estudio de EVs. Esta técnica utiliza una punta afilada sostenida por un voladizo flexible que escanea la muestra depositada en un soporte, línea por línea, y ajusta la distancia entre la punta y los elementos presentes a través de un bucle de retroalimentación. Esto permite caracterizar la topografía de la muestra y recolectar información morfomecánica15,16,17,18. Los EVs pueden ser escaneados por AFM ya sea después de ser depositados sobre un sustrato atómicamente plano o después de haber sido capturados sobre un sustrato específico funcionalizado por anticuerpos, péptidos o aptámeros para caracterizar las diversas subpoblaciones18,19. Debido a su capacidad para cuantificar y sondear simultáneamente la estructura, la biomecánica y el contenido biomolecular membranoso de EV dentro de muestras biológicas complejas sin necesidad de pretratamiento, etiquetado o deshidratación, AFM ahora se usa cada vez más para caracterizar EV de manera fina y multiparamétrica en condiciones fisiológicas de temperatura y medio.
Este artículo propone una metodología que utiliza un biochip de oro central capaz de ser (bio)funcionalizado químicamente en un formato multiplexado. Este sustrato es la piedra angular de una potente plataforma analítica que combina la biodetección de subconjuntos de EV por resonancia de plasmones de superficie, y una vez que los EVs son adsorbidos/injertados o inmunocapturados en el chip, AFM permite la caracterización metrológica y morfomecánica de los EVs. Junto con la firma Raman de los subconjuntos EV capturados en el chip, esta plataforma analítica permite la calificación de los EV presentes en muestras biológicas de una manera libre de etiquetas y sin necesidad de pasos preanalíticos. Este documento muestra que la combinación de técnicas poderosas, asistidas por una metodología altamente rigurosa en la preparación de sustratos y adquisición de datos, hace que el análisis EV sea profundo, definitivo y robusto.
El principio del enfoque propuesto es preparar un sustrato de oro, adsorber / injertar o capturar los subtipos de EV, y escanearlos por AFM para estimar el tamaño y la morfología de cada subconjunto de EV. Además, esos EV adsorbidos se analizan mediante espectroscopia Raman. Este sustrato puede, de hecho, presentar tres tipos de interfaces de complejidad creciente: desnudas, químicamente funcionalizadas o microarrays de ligandos. Antes de describir los diferentes pasos del protocolo, se remite a los lectores a la presentación esquemática del enfoque de la plataforma nanobioanalítica (NBA) en la Figura 1, que combina imágenes de resonancia de plasmones de superficie (SPRi), AFM y espectroscopia.
Figura 1: La plataforma NanoBioAnalítica. El enfoque combina (A) imágenes de resonancia de plasmones de superficie, (B) microscopía de fuerza atómica y espectroscopía infrarroja / Raman (nano), todas involucradas en el mismo sustrato: un chip de oro multiplexado. Abreviaturas: NBA = plataforma NanoBioAnalítica; SPRi = resonancia de plasmón de superficie; AFM = microscopía de fuerza atómica; EV = vesícula extracelular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El biochip de oro central constituye el corazón de la plataforma, ya que todas las técnicas de caracterización sin etiquetas se llevan a cabo en este biochip. De acuerdo con las necesidades de la caracterización de EV (ya sea EV globales / totales o subconjuntos de EV) y las limitaciones / demandas de los métodos utilizados, se han desarrollado tres tipos de superficies de biochip de oro: “desnudas”, químicamente funcionalizadas “C11 / C16” o ligando-biofuncionalizadas, llamadas superficie de oro “ligando”.
El biochip desnudo, llamado “desnudo“, permite la simple adsorción de vehículos eléctricos en oro. Es posible seleccionar el tampón utilizado y realizar esta adsorción de forma pasiva (pasos de incubación y luego enjuague) o monitorizarlo bajo flujo (en SPRi). Además, esta adsorción pasiva se puede realizar en todo el chip (como una macromatriz) o localizarse en micromatrices utilizando un observador de micropipetas. El “procedimiento bajo flujo” permite a los investigadores seguir la cinética y el nivel de adsorción EV. Este enfoque en el sustrato de oro desnudo se adopta cuando la interfaz de la capa química puede interferir con el método analítico (por ejemplo, para la espectroscopia Raman).
El biochip químicamente funcionalizado, llamado “C11/C16“, se utiliza para crear una “alfombra” densa y robusta de EVs unidos covalentemente en la superficie de oro formando enlaces amida primarios con los tiolatos cuando el objetivo es tener una visión global de la muestra EV. De hecho, en este caso, el oro es funcionalizado por una mezcla de tiolato de mercapto-1-undecanol (11-MUOH: “C11”) y ácido mercapto-1-hexadecanoico (16-MHA: “C16”), y una fracción de los tiolatos se activan químicamente para establecer la unión covalente con los objetivos. Una vez más, esta estrategia se puede realizar de forma pasiva (pasos de incubación y luego enjuague, ya sea en “macroarray” o en múltiples microarrays utilizando un observador de micropipetas) o bajo caudales (en SPRi) para seguir la cinética y el nivel de injerto EV en la superficie de oro.
El biochip ligando-biofuncionalizado, llamado “ligandos”, se activa químicamente para injertar covalentemente diferentes ligandos (por ejemplo, anticuerpos, receptores) para capturar selectivamente (con afinidad) diferentes subconjuntos de EV que coexisten en la muestra biológica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos recientes para la identificación de EV que son los más utilizados son el inmunoblotting específico de proteínas para confirmar el origen de los EV, TEM para confirmar su estructura y NTA para cuantificar su número y distribución de tamaño en un volumen de muestra3. Sin embargo, el gran interés en los vehículos eléctricos en la investigación (bio)médica y las limitaciones de las herramientas analíticas existentes han llevado a la comunidad científica a desarrollar nuevos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kelly Aubertin y Fabien Picot de la instalación central de IVETh (París) son reconocidos por los experimentos de imágenes Raman. Thierry Burnouf (Universidad Médica de Taipei, Taiwán) y Zuzana Krupova (de Helincourt, Francia) son reconocidos por proporcionar las muestras EV derivadas de muestras de plaquetas sanguíneas y leche bovina, respectivamente. El trabajo fue apoyado por la región Bourgogne Franche-Comté y la escuela de posgrado EUR EIPHI (proyecto NOVICE, 2021-2024). Parte de este trabajo se realizó utilizando la plataforma CLIPP y en las instalaciones de la sala limpia RENATECH en FEMTO-ENGINEERING, por lo que agradecemos a Rabah Zeggari.
Materials
| CD41a antibody | Diaclone SAS (France) | 447528 | |
| CP920 | Microparticles GmbH, Germany | 448303 | |
| DXR3xi | Thermo Fisher Scientific | T1502 | |
| EDC | Sigma | A6272 | |
| Ethanolamine | Sigma | P5368-10PAK | |
| Evs derived from platelet concentrates | Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei) | S2889 | |
| Evs from bovine milk | Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt – France) | 3450 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 56845 | |
| Gwyddion | 853.223.020 | ||
| Magnetron sputtering | PLASSYS | SAB5300165 | |
| mercapto-1-hexadecanoic acid | Sigma | G5882 | |
| Mercapto-1-undecanol | Sigma | O8001 | |
| Mountains SPIP ones | Digital Surf | ||
| NanoWizard 3 Bioscience | Bruker-JPK | ||
| Octyl Glucoside (OG) | Sigma | ||
| Ovalbumine antibody | Sigma | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | ||
| Rat Albumin Serum (RSA) | Sigma | ||
| Sodium acetate buffer | Sigma | ||
| SPR-Biacore 3000 | GE Healthcare/ Cytiva life sciences | ||
| SPRi Biochip | MIMENTO technology platform | The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon | |
| SPRi Plex II | Horiba Scientific | ||
| Sulfo-NHS | Sigma |
References
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