Multimodale Analyseplattform auf einem Multiplex-Oberflächenplasmonen-Resonanztomographie-Chip zur Analyse extrazellulärer Vesikel-Untergruppen
Summary
In diesem Artikel wird eine neue Generation multiparametrischer Analyseplattformen mit erhöhtem Durchsatz für die Charakterisierung von extrazellulären Vesikel-Untergruppen vorgeschlagen. Die Methode basiert auf einer Kombination von gemultiplexten Biosensormethoden mit metrologischen und morphomechanischen Analysen durch Rasterkraftmikroskopie, gekoppelt mit Raman-Spektroskopie, um vesikuläre Ziele zu qualifizieren, die auf einem Microarray-Biochip gefangen sind.
Abstract
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind membranabgeleitete, winzige Vesikel, die von allen Zellen mit einem Durchmesser von 50 bis mehreren hundert Nanometern produziert werden und als Mittel zur interzellulären Kommunikation verwendet werden. Sie entwickeln sich zu vielversprechenden diagnostischen und therapeutischen Instrumenten für eine Vielzahl von Krankheiten. Es gibt zwei Hauptbiogeneseprozesse, die von Zellen verwendet werden, um EVs mit Unterschieden in Größe, Zusammensetzung und Inhalt herzustellen. Aufgrund ihrer hohen Komplexität in Größe, Zusammensetzung und Zellherkunft erfordert ihre Charakterisierung eine Kombination von Analysetechniken. Dieses Projekt beinhaltet die Entwicklung einer neuen Generation von multiparametrischen Analyseplattformen mit erhöhtem Durchsatz für die Charakterisierung von Subpopulationen von Elektrofahrzeugen. Um dieses Ziel zu erreichen, geht die Arbeit von der von der Gruppe etablierten nanobioanalytischen Plattform (NBA) aus, die eine originelle Untersuchung von EVs auf der Grundlage einer Kombination von gemultiplexten Biosensormethoden mit metrologischen und morphomechanischen Analysen durch Rasterkraftmikroskopie (AFM) von vesikulären Targets ermöglicht, die auf einem Microarray-Biochip gefangen sind. Ziel war es, diese EV-Untersuchung mit einer phänotypischen und molekularen Analyse mittels Raman-Spektroskopie abzuschließen. Diese Entwicklungen ermöglichen den Vorschlag einer multimodalen und einfach zu bedienenden analytischen Lösung für die Unterscheidung von EV-Untergruppen in biologischen Flüssigkeiten mit klinischem Potenzial
Introduction
Das wachsende Interesse an der EV-Forschung in der Diagnose und in der Therapie 1,2,3,4,5, kombiniert mit den Herausforderungen, mit denen dieses Feld konfrontiert ist, hat zur Entwicklung und Implementierung einer Vielzahl von Ansätzen und Techniken zur Quantifizierung oder Charakterisierung dieser Vesikel geführt. Die am weitesten verbreiteten Methoden zur Identifizierung von EVs sind proteinspezifisches Immunblotting und Proteomik, um die Herkunft von EVs zu bestätigen, Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), um ihre Struktur zu bestätigen, und Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), um ihre Anzahl und Größenverteilung in einem Probenvolumen zu quantifizieren.
Keine dieser Techniken allein liefert jedoch alle Informationen, die zur Charakterisierung von EV-Untergruppen erforderlich sind. Die inhärente Heterogenität von Elektrofahrzeugen aufgrund der Vielfalt ihrer biochemischen und physikalischen Eigenschaften erschwert globale Analysen, die zuverlässig und reproduzierbar sind, insbesondere für Elektrofahrzeuge, die in einem Gemisch (Rohprobe) enthalten sind. Detektions- und Charakterisierungsmethoden sind daher für Elektrofahrzeuge sowohl einzeln als auch allgemein erforderlich, um andere Methoden zu ergänzen, die schneller, aber nicht selektiv sind6.
Die hochauflösende Bildgebung mittels TEM (oder KryoTEM) oder AFM ermöglicht die Bestimmung der Morphologie und Metrologie von EVs mit einer nanometrischen Auflösungvon 7,8,9,10,11,12. Die Haupteinschränkung bei der Verwendung der Elektronenmikroskopie für biologische Objekte, wie z. B. Elektrofahrzeuge, ist jedoch die Notwendigkeit eines Vakuums zur Durchführung der Studie, die die Fixierung und Dehydratisierung der Probe erfordert. Eine solche Präparation macht es schwierig, von den beobachteten Strukturen auf die EV-Morphologie in Lösung zu übertragen. Um diese Dehydratisierung der Probe zu vermeiden, ist die Technik der KryoTEM für die EV-Charakterisierung am besten geeignet13. Es wird häufig zur Bestimmung der Ultrastruktur von Elektrofahrzeugen verwendet. Die Immunmarkierung von Vesikeln durch biofunktionalisierte Goldnanopartikel ermöglicht es auch, spezifische Subpopulationen von EVs zu identifizieren und sie von anderen Partikeln zu unterscheiden, die in einer komplexen biologischen Probe vorhanden sind. Aufgrund der geringen Anzahl von EVs, die durch Elektronenmikroskopie analysiert werden, ist es jedoch oft schwierig, eine Charakterisierung durchzuführen, die für eine komplexe und heterogene Probe repräsentativ ist.
Um diese Größenheterogenität aufzudecken, schlägt die International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) vor, eine ausreichende Anzahl von Weitfeldbildern zu analysieren, begleitet von kleineren Bildern, um einzelne EVs mit hoher Auflösung zu enthüllen14. AFM ist eine Alternative zu optischen Ansätzen und elektronischen Beugungstechniken für die Untersuchung von Elektrofahrzeugen. Bei dieser Technik wird eine scharfe Spitze verwendet, die von einem flexiblen Ausleger gehalten wird, der die auf einem Träger abgelagerte Probe Zeile für Zeile abtastet und den Abstand zwischen der Spitze und den vorhandenen Elementen durch eine Rückkopplungsschleife anpasst. Dies ermöglicht es, die Topographie der Probe zu charakterisieren und morphomechanische Informationen zu sammeln15,16,17,18. Die EVs können mittels AFM gescannt werden, nachdem sie entweder auf einem atomar flachen Substrat abgeschieden wurden oder nachdem sie auf einem spezifischen Substrat eingefangen wurden, das durch Antikörper, Peptide oder Aptamere funktionalisiert wurde, um die verschiedenen Subpopulationen zu charakterisieren18,19. Aufgrund seiner Fähigkeit, die Struktur, die Biomechanik und den membranösen biomolekularen Gehalt von EVs in komplexen biologischen Proben zu quantifizieren und gleichzeitig zu untersuchen, ohne dass eine Vorbehandlung, Markierung oder Dehydratisierung erforderlich ist, wird AFM nun zunehmend zur feinen und multiparametrischen Charakterisierung von EVs unter physiologischen Bedingungen von Temperatur und Medium eingesetzt.
In diesem Artikel wird eine Methodik vorgeschlagen, bei der ein Kern-Gold-Biochip verwendet wird, der in einem Multiplex-Format (bio)chemisch funktionalisiert werden kann. Dieses Substrat ist der Eckpfeiler einer leistungsstarken analytischen Plattform, die die biologische Detektion von EV-Untergruppen durch Oberflächenplasmonenresonanz kombiniert, und sobald die EVs auf dem Chip adsorbiert/gepfropft oder immuneingefangen sind, ermöglicht AFM die metrologische und morphomechanische Charakterisierung der EVs. In Verbindung mit der Raman-Signatur der auf dem Chip erfassten EV-Untergruppen ermöglicht diese Analyseplattform die Qualifizierung der in biologischen Proben vorhandenen EVs markierungsfrei und ohne präanalytische Schritte. Dieses Papier zeigt, dass die Kombination aus leistungsstarken Techniken, unterstützt durch eine sehr strenge Methodik bei der Substratvorbereitung und Datenerfassung, die EV-Analyse tiefgreifend, definitiv und robust macht.
Das Prinzip des vorgeschlagenen Ansatzes besteht darin, ein Goldsubstrat herzustellen, die EV-Subtypen zu adsorbieren/pfropfen oder einzufangen und sie mit AFM zu scannen, um die Größe und Morphologie jeder EV-Untergruppe abzuschätzen. Zusätzlich werden diese adsorbierten EVs mittels Raman-Spektroskopie analysiert. Dieses Substrat kann in der Tat drei Arten von Grenzflächen mit wachsender Komplexität aufweisen: nackte, chemisch funktionalisierte oder Liganden-Microarrays. Bevor die verschiedenen Schritte des Protokolls beschrieben werden, wird auf die schematische Darstellung des Ansatzes der nanobioanalytischen Plattform (NBA) in Abbildung 1 verwiesen, der Oberflächenplasmonenresonanztomographie (SPRi), AFM und Spektroskopie kombiniert.
Abbildung 1: Die NanoBioAnalytical Plattform. Der Ansatz kombiniert (A) Oberflächenplasmonenresonanztomographie, (B) Rasterkraftmikroskopie und Infrarot/Raman-(Nano-)Spektroskopie, die alle auf demselben Substrat – einem Multiplex-Goldchip – eingesetzt werden. Abkürzungen: NBA = NanoBioAnalytical platform; SPRi = Oberflächenplasmonen-Resonanztomographie; AFM = Rasterkraftmikroskopie; EV = extrazelluläres Vesikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Der Kern-Gold-Biochip bildet das Herzstück der Plattform, da alle markierungsfreien Charakterisierungstechniken auf diesem Biochip durchgeführt werden. Entsprechend den Anforderungen der EV-Charakterisierung (entweder globale/totale EVs oder EV-Untergruppen) und den Einschränkungen/Anforderungen der verwendeten Methoden wurden drei Arten von Gold-Biochip-Oberflächen entwickelt: entweder “nackte”, chemisch funktionalisierte “C11/C16” oder ligandenbiofunktionalisierte, als “Liganden”-Goldoberfläche bezeichnete Goldoberfläche.
Der nackte Biochip, “nackt” genannt, ermöglicht die einfache Adsorption von Elektrofahrzeugen auf Gold. Es ist möglich, den verwendeten Puffer auszuwählen und diese Adsorption entweder passiv (Inkubations- und Spülschritte) oder unter Durchfluss (in SPRi) zu überwachen. Darüber hinaus kann diese passive Adsorption entweder auf dem gesamten Chip (als Makroarray) oder in Microarrays mit einem Mikropipetten-Spotter lokalisiert werden. Das “Under Flow-Verfahren” ermöglicht es den Ermittlern, die Kinetik und das Ausmaß der EV-Adsorption zu verfolgen. Dieser Ansatz auf dem nackten Goldsubstrat wird angewendet, wenn die chemische Schichtgrenzfläche die analytische Methode stören kann (z. B. für die Raman-Spektroskopie).
Der chemisch funktionalisierte Biochip mit der Bezeichnung “C11/C16” wird verwendet, um einen dichten und robusten “Teppich” aus EVs zu erzeugen, die kovalent an der Goldoberfläche gebunden sind, indem primäre Amidbindungen mit den Thiolaten gebildet werden, wenn das Ziel darin besteht, eine globale Sicht auf die EV-Probe zu erhalten. Tatsächlich wird das Gold in diesem Fall durch eine Thiolatmischung aus Mercapto-1-undecanol (11-MUOH: “C11”) und Mercapto-1-hexadecansäure (16-MHA: “C16”) funktionalisiert, und ein Teil der Thiolate wird chemisch aktiviert, um eine kovalente Bindung an die Ziele herzustellen. Auch diese Strategie kann entweder passiv (Inkubations- und anschließende Spülschritte, entweder in “Makroarrays” oder in mehreren Mikroarrays mit einem Mikropipetten-Spotter) oder unter Durchflussraten (in SPRi) realisiert werden, um die Kinetik und den Grad der EV-Pfropfung auf der Goldoberfläche zu verfolgen.
Der liganden-biofunktionalisierte Biochip, der als “Liganden” bezeichnet wird, wird chemisch aktiviert, um verschiedene Liganden (z. B. Antikörper, Rezeptoren) kovalent zu transplantieren, um selektiv (mit Affinität) verschiedene EV-Untergruppen zu erfassen, die in der biologischen Probe koexistieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die neueren Methoden zur Identifizierung von EVs, die am weitesten verbreitet sind, sind proteinspezifisches Immunblotting, um die Herkunft von EVs zu bestätigen, TEM, um ihre Struktur zu bestätigen, und NTA, um ihre Anzahl und Größenverteilung in einem Probenvolumen3 zu quantifizieren. Nichtsdestotrotz haben das große Interesse an Elektrofahrzeugen in der (bio-)medizinischen Forschung und die Einschränkungen bestehender Analysewerkzeuge die wissenschaftliche Gemeinschaft dazu veranlasst, ne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kelly Aubertin und Fabien Picot von der IVETh Core Facility (Paris) werden für die Raman-Bildgebungsexperimente ausgezeichnet. Thierry Burnouf (Taipei Medical University, Taiwan) und Zuzana Krupova (aus Helincourt, Frankreich) werden für die Bereitstellung der EV-Proben aus Blutplättchen- bzw. Rindermilchproben ausgezeichnet. Die Arbeit wurde von der Region Bourgogne Franche-Comté und der Graduiertenschule EUR EIPHI (NOVICE-Projekt, 2021-2024) unterstützt. Ein Teil dieser Arbeit wurde mit der CLIPP-Plattform und in RENATECH-Reinraumanlagen in FEMTO-ENGINEERING durchgeführt, wofür wir Rabah Zeggari danken.
Materials
| CD41a antibody | Diaclone SAS (France) | 447528 | |
| CP920 | Microparticles GmbH, Germany | 448303 | |
| DXR3xi | Thermo Fisher Scientific | T1502 | |
| EDC | Sigma | A6272 | |
| Ethanolamine | Sigma | P5368-10PAK | |
| Evs derived from platelet concentrates | Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei) | S2889 | |
| Evs from bovine milk | Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt – France) | 3450 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 56845 | |
| Gwyddion | 853.223.020 | ||
| Magnetron sputtering | PLASSYS | SAB5300165 | |
| mercapto-1-hexadecanoic acid | Sigma | G5882 | |
| Mercapto-1-undecanol | Sigma | O8001 | |
| Mountains SPIP ones | Digital Surf | ||
| NanoWizard 3 Bioscience | Bruker-JPK | ||
| Octyl Glucoside (OG) | Sigma | ||
| Ovalbumine antibody | Sigma | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | ||
| Rat Albumin Serum (RSA) | Sigma | ||
| Sodium acetate buffer | Sigma | ||
| SPR-Biacore 3000 | GE Healthcare/ Cytiva life sciences | ||
| SPRi Biochip | MIMENTO technology platform | The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon | |
| SPRi Plex II | Horiba Scientific | ||
| Sulfo-NHS | Sigma |
References
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