פלטפורמה אנליטית רב-מודאלית על שבב דימות תהודה פלסמון מרובה פני שטח לניתוח תת-קבוצות שלפוחית חוץ-תאית
Summary
מאמר זה מציע דור חדש של פלטפורמות אנליטיות רב-פרמטריות עם תפוקה מוגברת לאפיון תת-קבוצות שלפוחית חוץ-תאיות. השיטה מבוססת על שילוב של שיטות חישה ביולוגית מרובות עם אנליזות מטרולוגיות ומורפומכניות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי, יחד עם ספקטרוסקופיית ראמאן, כדי להכשיר מטרות שלפוחיתיות הכלואות על שבב ביולוגי של מיקרו-מערך.
Abstract
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן שלפוחיות זעירות שמקורן בקרום, המיוצרות על ידי כל התאים בקוטר של בין 50 לכמה מאות ננומטרים ומשמשות כאמצעי לתקשורת בין-תאית. הם מסתמנים ככלי אבחון וטיפול מבטיחים למגוון מחלות. ישנם שני תהליכי ביוגנזה עיקריים המשמשים תאים לייצור כלי רכב חשמליים עם הבדלים בגודל, בהרכב ובתוכן. בשל מורכבותם הגבוהה בגודלם, הרכבם ומוצא התא, אפיונם דורש שילוב של טכניקות אנליטיות. פרויקט זה כולל פיתוח דור חדש של פלטפורמות אנליטיות מולטי-פרמטריות עם תפוקה מוגברת לאפיון תת-אוכלוסיות של כלי רכב חשמליים. כדי להשיג מטרה זו, העבודה מתחילה מהפלטפורמה הננו-ביואנליטית (NBA) שהוקמה על ידי הקבוצה, המאפשרת חקירה מקורית של כלי רכב חשמליים המבוססת על שילוב של שיטות ביו-חישה מרובות עם ניתוחים מטרולוגיים ומורפומכניים על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) של מטרות שלפוחיתיות הכלואות על שבב ביולוגי של מיקרו-מערך. המטרה הייתה להשלים את חקירת הרכב החשמלי באמצעות ניתוח פנוטיפי ומולקולרי על ידי ספקטרוסקופיית ראמאן. פיתוחים אלה מאפשרים להציע פתרון אנליטי רב-מודאלי וקל לשימוש להבחנה בין תת-קבוצות של כלי רכב חשמליים בנוזלים ביולוגיים בעלי פוטנציאל קליני
Introduction
העניין הגובר במחקר EV באבחון ובטיפולים 1,2,3,4,5, בשילוב עם האתגרים העומדים בפני תחום זה, הביאו לפיתוח ויישום של מגוון רחב של גישות וטכניקות לכימות או אפיון שלפוחיות אלה. השיטות הנפוצות ביותר לזיהוי EV הן אימונובלוטציה ספציפית לחלבון ופרוטאומיקה כדי לאשר את מקורם של כלי רכב חשמליים, מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) כדי לאשר את המבנה שלהם, וניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) כדי לכמת את מספרם ואת התפלגות גודלם בנפח דגימה.
עם זאת, אף אחת מהטכניקות הללו כשלעצמה אינה מספקת את כל המידע הדרוש כדי לאפיין תת-קבוצות של כלי רכב חשמליים. ההטרוגניות המובנית של כלי רכב חשמליים בשל הגיוון בתכונות הביוכימיות והפיזיקליות שלהם מונעת ניתוחים גלובליים אמינים וניתנים לשחזור, במיוחד עבור כלי רכב חשמליים הכלולים בתערובת (מדגם גולמי). לכן, יש צורך בשיטות איתור ואפיון עבור כלי רכב חשמליים, הן באופן פרטני והן באופן כללי כדי להשלים שיטות אחרות שהן מהירות יותר אך לא סלקטיביות6.
הדמיה ברזולוציה גבוהה על ידי TEM (או cryoTEM) או AFM מאפשרת לקבוע את המורפולוגיה והמטרולוגיה של כלי רכב חשמליים ברזולוציה ננומטרית 7,8,9,10,11,12. עם זאת, המגבלה העיקרית של השימוש במיקרוסקופ אלקטרונים עבור אובייקטים ביולוגיים, כגון EVs, היא הצורך בוואקום לביצוע המחקר הדורש קיבוע והתייבשות של הדגימה. הכנה כזו מקשה על התרגום מהמבנים שנצפו למורפולוגיה של EV בתמיסה. כדי למנוע התייבשות זו של הדגימה, הטכניקה של cryoTEM היא המתאימה ביותר לאפיון EV13. הוא נמצא בשימוש נרחב לקביעת מבנה העל של כלי רכב חשמליים. הסימון החיסוני של שלפוחיות על ידי ננו-חלקיקי זהב ביו-פונקציונליים מאפשר גם לזהות תת-אוכלוסיות ספציפיות של כלי רכב חשמליים ולהבדיל אותן מחלקיקים אחרים הנמצאים בדגימה ביולוגית מורכבת. עם זאת, בשל המספר הנמוך של כלי רכב חשמליים המנותחים במיקרוסקופ אלקטרוני, לעיתים קרובות קשה לבצע אפיון המייצג מדגם מורכב והטרוגני.
כדי לחשוף את ההטרוגניות בגודל זה, האגודה הבינלאומית לשלפוחיות חוץ-תאיות (ISEV) מציעה לנתח מספר מספיק של תמונות שדה רחב, בליווי תמונות קטנות יותר, כדי לחשוף כלי רכב חשמליים בודדים ברזולוציה גבוהה14. AFM הוא חלופה לגישות אופטיות וטכניקות עקיפה אלקטרוניות לחקר כלי רכב חשמליים. טכניקה זו משתמשת בקצה חד המוחזק על ידי מקל גמיש הסורק את הדגימה שהונחה על תמיכה אחת, שורה אחר שורה, ומתאים את המרחק בין הקצה לבין האלמנטים הנוכחים באמצעות לולאת משוב. זה מאפשר לאפיין את הטופוגרפיה של המדגם ולאסוף מידע מורפומכני15,16,17,18. ניתן לסרוק את כלי הרכב החשמליים על ידי AFM לאחר שהופקדו על מצע שטוח אטומית או לאחר שנלכדו על מצע ספציפי המתפקד על ידי נוגדנים, פפטידים או אפטמרים כדי לאפיין את תת-האוכלוסיות השונות18,19. בשל יכולתו לכמת ובו זמנית את המבנה, הביומכניקה והתכולה הביומולקולרית הממברנית של כלי רכב חשמליים בתוך דגימות ביולוגיות מורכבות ללא צורך בטיפול מקדים, תיוג או התייבשות, AFM משמש כיום יותר ויותר לאפיון כלי רכב חשמליים בצורה עדינה ורב-פרמטרית בתנאים פיזיולוגיים של טמפרטורה ומדיום.
מאמר זה מציע מתודולוגיה המשתמשת בביו-שבב זהב ליבה המסוגל להיות (ביו) פונקציונלי כימית בפורמט מרובה. מצע זה הוא אבן הפינה של פלטפורמה אנליטית רבת עוצמה המשלבת זיהוי ביולוגי של תת-קבוצות EV על ידי תהודה פלסמונית על פני השטח, וברגע שכלי הרכב החשמליים נספגים/מושתלים או נלכדים חיסון על השבב, AFM מאפשר אפיון מטרולוגי ומורפומכני של כלי הרכב החשמליים. יחד עם חתימת ראמאן של תת-קבוצות הרכב החשמלי שנלכדו על השבב, פלטפורמה אנליטית זו מאפשרת את ההסמכה של כלי הרכב החשמליים הנמצאים בדגימות ביולוגיות באופן ללא תוויות וללא כל צורך בצעדים פרה-אנליטיים. מאמר זה מראה כי השילוב של טכניקות רבות-עוצמה, בסיוע מתודולוגיה קפדנית ביותר בהכנת מצעים ורכישת נתונים, הופך את ניתוח הרכב החשמלי לעמוק, מוחלט וחזק.
העיקרון של הגישה המוצעת הוא להכין מצע זהב, לספוח/להשתיל או ללכוד את תת-הסוגים של EV, ולסרוק אותם על ידי AFM כדי להעריך את הגודל והמורפולוגיה של כל תת-קבוצה של EV. בנוסף, כלי הרכב החשמליים הנספחים מנותחים על ידי ספקטרוסקופיית ראמאן. מצע זה יכול, אכן, להציג שלושה סוגים של ממשקים בעלי מורכבות הולכת וגדלה: עירום, פונקציונלי כימית, או מיקרו-מערכי ליגנד. לפני תיאור השלבים השונים של הפרוטוקול, הקוראים מופנים להצגה הסכמטית של גישת הפלטפורמה הננו-ביואנליטית (NBA) באיור 1, המשלבת דימות תהודה פלסמוני פני השטח (SPRi), AFM וספקטרוסקופיה.
איור 1: הפלטפורמה הננו-ביואנליטית. הגישה משלבת (A) הדמיית תהודה פלסמונית על פני השטח, (B) מיקרוסקופ כוח אטומי, וספקטרוסקופיית אינפרא אדום/ראמאן (ננו), כולם עוסקים על אותו מצע – שבב זהב מרובה. קיצורים: NBA = פלטפורמה ננו-ביואנליטית; SPRi = הדמיית תהודה פלסמונית פני השטח; AFM = מיקרוסקופ כוח אטומי; EV = שלפוחית חוץ-תאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
ביו-שבב הזהב מהווה את לב הפלטפורמה מכיוון שכל טכניקות האפיון ללא תוויות מתבצעות על שבב זה. בהתאם לצרכים של אפיון הרכב החשמלי (תת-קבוצות גלובליות/כלל של כלי רכב חשמליים או תת-קבוצות של כלי רכב חשמליים) והמגבלות/הדרישות של השיטות בהן נעשה שימוש, פותחו שלושה סוגים של משטחי ביו-שבב זהב: או “עירום”, “C11/C16” המתפקד כימית, או ליגנד-ביו-פונקציונלי, המכונה משטח זהב “ליגנד”.
השבב העירום, המכונה “עירום“, מאפשר ספיחה פשוטה של כלי רכב חשמליים על זהב. ניתן לבחור את המאגר המשמש ולממש ספיחה זו באופן פסיבי (שלבי דגירה ולאחר מכן שטיפה) או לפקח עליו תחת זרימה (ב SPRi). יתר על כן, ספיחה פסיבית זו יכולה להתממש או על השבב כולו (כמו macroarray) או מקומי microarrays באמצעות ספוטר micropipette. “נוהל הזרימה” מאפשר לחוקרים לעקוב אחר הקינטיקה ורמת ספיחת הרכב החשמלי. גישה זו על מצע הזהב העירום מאומצת כאשר ממשק השכבה הכימית עלול להפריע לשיטה האנליטית (למשל, עבור ספקטרוסקופיית ראמאן).
השבב הביולוגי המתפקד כימית, הנקרא “C11/C16“, משמש ליצירת “שטיח” צפוף וחזק של כלי רכב חשמליים הקשורים באופן קוולנטי על פני הזהב על ידי יצירת קשרי אמיד ראשוניים עם התיולטים כאשר המטרה היא לקבל מבט גלובלי על דגימת הרכב החשמלי. ואכן, במקרה זה, הזהב מתפקד על ידי תערובת תיולאט של mercapto-1-undecanol (11-MUOH: “C11”) וחומצה mercapto-1-hexadecanoic (16-MHA: “C16″), וחלק קטן של thiolates מופעלים כימית כדי ליצור קישור קוולנטי עם המטרות. שוב, אסטרטגיה זו יכולה להתממש באופן פסיבי (שלבי דגירה ולאחר מכן שטיפה, או ב”מקרו-מערך” או במספר מיקרו-מערכים באמצעות ספוטר מיקרופיפטה) או תחת קצבי זרימה (ב-SPRi) כדי לעקוב אחר הקינטיקה ורמת השתלת הרכב החשמלי על משטח הזהב.
השבב הביולוגי של הליגנד, הנקרא “ליגנדים”, מופעל כימית כדי להשתיל באופן קוולנטי ליגנדים שונים (למשל, נוגדנים, קולטנים) כדי ללכוד באופן סלקטיבי (עם זיקה) תת-קבוצות שונות של EV המתקיימות יחד בדגימה הביולוגית.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות האחרונות לזיהוי EV שנמצאות בשימוש הנרחב ביותר הן אימונובלוטינג ספציפי לחלבון כדי לאשר את מקורם של כלי רכב חשמליים, TEM כדי לאשר את המבנה שלהם, ונת”ע כדי לכמת את התפלגות מספרם וגודלם במדגםנפח 3. עם זאת, העניין הרב ברכבים חשמליים במחקר (ביו)רפואי והמגבלות של הכלים האנליטיים ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
קלי אוברטין ופביאן פיקו ממתקן הליבה IVETh (פריז) מוכרים על ניסויי ההדמיה של ראמאן. תיירי בורנוף (האוניברסיטה הרפואית של טאיפיי, טייוואן) וזוזנה קרופובה (מהלינקור, צרפת) מוכרים על מתן דגימות EV שמקורן בדגימות טסיות דם וחלב בקר, בהתאמה. העבודה נתמכה על ידי אזור Bourgogne Franche-Comté ובית הספר לתארים מתקדמים EUR EIPHI (פרויקט טירון, 2021-2024). חלק מעבודה זו נעשתה באמצעות פלטפורמת CLIPP ובמתקני החדרים הנקיים של RENATECH ב-FEMTO-ENGINEERING, ועל כך אנו מודים לרבאח זגרי.
Materials
| CD41a antibody | Diaclone SAS (France) | 447528 | |
| CP920 | Microparticles GmbH, Germany | 448303 | |
| DXR3xi | Thermo Fisher Scientific | T1502 | |
| EDC | Sigma | A6272 | |
| Ethanolamine | Sigma | P5368-10PAK | |
| Evs derived from platelet concentrates | Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei) | S2889 | |
| Evs from bovine milk | Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt – France) | 3450 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 56845 | |
| Gwyddion | 853.223.020 | ||
| Magnetron sputtering | PLASSYS | SAB5300165 | |
| mercapto-1-hexadecanoic acid | Sigma | G5882 | |
| Mercapto-1-undecanol | Sigma | O8001 | |
| Mountains SPIP ones | Digital Surf | ||
| NanoWizard 3 Bioscience | Bruker-JPK | ||
| Octyl Glucoside (OG) | Sigma | ||
| Ovalbumine antibody | Sigma | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | ||
| Rat Albumin Serum (RSA) | Sigma | ||
| Sodium acetate buffer | Sigma | ||
| SPR-Biacore 3000 | GE Healthcare/ Cytiva life sciences | ||
| SPRi Biochip | MIMENTO technology platform | The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon | |
| SPRi Plex II | Horiba Scientific | ||
| Sulfo-NHS | Sigma |
References
- Silva, A. K. A., et al. Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group "Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs – EVOLVE France". Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001 (2021).
- Xunian, Z., Kalluri, R. Biology and therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes. Cancer Science. 111 (9), 3100-3110 (2020).
- Hartjes, T. A., et al. Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches. Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).
- Xing, Y., et al. Analysis of extracellular vesicles as emerging theranostic nanoplatforms. Coordination Chemistry Reviews. 424, 213506 (2020).
- Wang, T., Xing, Y., Cheng, Z., Yu, F. Analysis of single extracellular vesicles for biomedical applications with especial emphasis on cancer investigations. Trends in Analytical Chemistry. 152, 116604 (2022).
- Boireau, W., Elie-Caille, C. Extracellular vesicles: Definition, isolation and characterization. Medecine Sciences: M/S. 37 (12), 1092-1100 (2021).
- Brisson, A. R., et al. Extracellular vesicles from activated platelets: A semiquantitative cryo-electron microscopy and immuno-gold labeling study. Platelets. 28 (3), 263-271 (2017).
- Yuana, Y., et al. Atomic force microscopy: A novel approach to the detection of nanosized blood microparticles. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (2), 315-323 (2010).
- Sebaihi, N., de Boeck, B., Yuana, Y., Nieuwland, R., Pétry, J. Dimensional characterization of extracellular vesicles using atomic force microscopy. Measurement Science and Technology. 28 (3), 034006 (2017).
- Beekman, P., et al. Immuno-capture of extracellular vesicles for individual multi-modal characterization using AFM, SEM and Raman spectroscopy. Lab on a Chip. 19 (15), 2526-2536 (2019).
- Malenica, M., et al. Perspectives of microscopy methods for morphology characterisation of extracellular vesicles from human biofluids. Biomedicines. 9 (6), 603 (2021).
- Verweij, F. J., et al. The power of imaging to understand extracellular vesicle biology in vivo. Nature Methods. 18 (9), 1013-1026 (2021).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Obeid, S., et al. NanoBioAnalytical characterization of extracellular vesicles in 75-nm nanofiltered human plasma for transfusion: A tool to improve transfusion safety. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 101977 (2019).
- Obeid, S., et al. Development of a NanoBioAnalytical platform for «on-chip» qualification and quantification of platelet-derived microparticles. Biosensors and Bioelectronics. 93, 250-259 (2017).
- Ridolfi, A., et al. AFM-based high-throughput nanomechanical screening of single extracellular vesicles. Analytical Chemistry. 92 (15), 10274-10282 (2020).
- Vorselen, D., et al. The fluid membrane determines mechanics of erythrocyte extracellular vesicles and is softened in hereditary spherocytosis. Nature Communications. 9 (1), 4960 (2018).
- Hardij, J., et al. Characterisation of tissue factor bearing extracellular vesicles with AFM: Comparison of air-tapping-mode AFM and liquid Peak Force AFM. Journal of Extracellular Vesicles. 2, 21045 (2013).
- Jorgensen, M., et al. Extracellular Vesicle (EV) Array: Microarray capturing of exosomes and other extracellular vesicles for multiplexed phenotyping. Journal of Extracellular Vesicles. 2, 20920 (2013).
- Remy-Martin, F., et al. Surface plasmon resonance imaging in arrays coupled with mass spectrometry (SUPRA-MS): Proof of concept of on-chip characterization of a potential breast cancer marker in human plasma. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (2), 423-432 (2012).
- Czamara, K., et al. Raman spectroscopy of lipids: A review. Journal of Raman Spectroscopy. 46 (1), 4-20 (2015).
- Penders, J., et al. Single particle automated Raman trapping analysis of breast cancer cell-derived extracellular vesicles as cancer biomarkers. ACS Nano. 15 (11), 18192-18205 (2021).
- Baek, S. J., Park, A., Ahn, Y. J., Choo, J. Baseline correction using asymmetrically reweighted penalized least squares smoothing. Analyst. 140 (1), 250-257 (2015).
- Daaboul, G. G., et al. Digital detection of exosomes by interferometric imaging. Scientific Reports. 6, 37246 (2016).
- Ertsgaard, C. T., et al. Integrated nanogap platform for sub-volt dielectrophoretic trapping and real-time Raman imaging of biological nanoparticles. Nano Letters. 18 (9), 5946-5953 (2018).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
