Plataforma Analítica Multimodal em um Chip de Ressonância de Plasmon de Superfície Multiplexada para a Análise de Subconjuntos de Vesículas Extracelulares
Summary
Este trabalho propõe uma nova geração de plataformas analíticas multiparamétricas com maior rendimento para a caracterização de subconjuntos de vesículas extracelulares. O método é baseado em uma combinação de métodos de biossensoriamento multiplexado com análises metrológicas e morfomecânicas por microscopia de força atômica, juntamente com espectroscopia Raman, para qualificar alvos vesiculares presos em um biochip de microarray.
Abstract
As vesículas extracelulares (EVs) são minúsculas vesículas derivadas de membrana produzidas por todas as células que variam de 50 a várias centenas de nanômetros de diâmetro e são usadas como meio de comunicação intercelular. Eles estão emergindo como ferramentas diagnósticas e terapêuticas promissoras para uma variedade de doenças. Existem dois processos principais de biogênese usados pelas células para produzir EVs com diferenças de tamanho, composição e conteúdo. Devido à sua alta complexidade em tamanho, composição e origem celular, sua caracterização requer uma combinação de técnicas analíticas. Este projeto envolve o desenvolvimento de uma nova geração de plataformas analíticas multiparamétricas com maior rendimento para a caracterização de subpopulações de VEs. Para atingir esse objetivo, o trabalho parte da plataforma nanobioanalítica (NBA) estabelecida pelo grupo, que permite uma investigação original de EVs com base em uma combinação de métodos de biossensoriamento multiplexados com análises metrológicas e morfomecânicas por microscopia de força atômica (AFM) de alvos vesiculares presos em um biochip de microarray. O objetivo foi completar esta investigação de EV com uma análise fenotípica e molecular por espectroscopia Raman. Esses desenvolvimentos permitem a proposta de uma solução analítica multimodal e fácil de usar para a discriminação de subconjuntos de EV em fluidos biológicos com potencial clínico
Introduction
O crescente interesse na pesquisa de EV em diagnóstico e terapêutica 1,2,3,4,5, aliado aos desafios enfrentados por esse campo, resultou no desenvolvimento e implementação de uma grande variedade de abordagens e técnicas para quantificar ou caracterizar essas vesículas. Os métodos mais utilizados para a identificação de EV são imunoblotting e proteômica específicos de proteínas para confirmar a origem dos EVs, microscopia eletrônica de transmissão (MET) para confirmar sua estrutura e análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) para quantificar sua distribuição de número e tamanho em um volume de amostra.
Nenhuma dessas técnicas, por si só, no entanto, fornece todas as informações necessárias para caracterizar os subconjuntos de EV. A heterogeneidade inerente dos VEs devido à diversidade em suas propriedades bioquímicas e físicas impede análises globais confiáveis e reprodutíveis, especialmente para EVs contidos em uma mistura (amostra bruta). Métodos de detecção e caracterização são, portanto, necessários para os VEs, tanto individualmente quanto em geral, para complementar outros métodos mais rápidos, mas não seletivos6.
A imagem de alta resolução por MET (ou cryoTEM) ou AFM permite a determinação da morfologia e metrologia de EVs com resolução nanométrica 7,8,9,10,11,12. No entanto, a principal limitação do uso da microscopia eletrônica para objetos biológicos, como os EVs, é a necessidade de um vácuo para realizar o estudo, o que requer a fixação e desidratação da amostra. Tal preparo dificulta a tradução das estruturas observadas para a morfologia do VE em solução. Para evitar essa desidratação da amostra, a técnica de crioTEM é a mais adequada para caracterização do VE13. É amplamente utilizado para determinar a ultraestrutura dos VEs. A imunomarcação de vesículas por nanopartículas de ouro biofuncionalizadas também permite identificar subpopulações específicas de EVs e distingui-las de outras partículas presentes em uma amostra biológica complexa. No entanto, devido ao baixo número de EVs analisados por microscopia eletrônica, muitas vezes é difícil realizar uma caracterização que seja representativa de uma amostra complexa e heterogênea.
Para revelar essa heterogeneidade de tamanho, a International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) sugere a análise de um número suficiente de imagens de campo amplo, acompanhadas de imagens menores, para revelar EVs individuais com alta resolução14. O AFM é uma alternativa às abordagens ópticas e técnicas de difração eletrônica para o estudo de VEs. Esta técnica usa uma ponta afiada mantida por um cantilever flexível que digitaliza a amostra depositada em um suporte, linha por linha, e ajusta a distância entre a ponta e os elementos presentes através de um loop de feedback. Isso permite caracterizar a topografia da amostra e coletar informações morfomecânicas15,16,17,18. Os EVs podem ser escaneados por AFM após serem depositados em um substrato atomicamente plano ou após terem sido capturados em um substrato específico funcionalizado por anticorpos, peptídeos ou aptâmeros para caracterizar as várias subpopulações18,19. Devido à sua capacidade de quantificar e sondar simultaneamente a estrutura, a biomecânica e o conteúdo biomolecular membranoso de EVs dentro de amostras biológicas complexas sem a necessidade de pré-tratamento, marcação ou desidratação, o AFM é agora cada vez mais usado para caracterizar EVs de maneira fina e multiparamétrica sob condições fisiológicas de temperatura e meio.
Este trabalho propõe uma metodologia utilizando um núcleo de biochip de ouro capaz de ser (bio)quimicamente funcionalizado em um formato multiplexado. Este substrato é a pedra angular de uma poderosa plataforma analítica que combina a biodetecção de subconjuntos de EV por ressonância plasmônica de superfície e, uma vez que os EVs são adsorvidos / enxertados ou imunocapturados no chip, o AFM permite a caracterização metrológica e morfomecânica dos EVs. Juntamente com a assinatura Raman dos subconjuntos EV capturados no chip, esta plataforma analítica permite a qualificação dos EVs presentes em amostras biológicas de forma livre de rótulo e sem qualquer necessidade de etapas pré-analíticas. Este trabalho mostra que a combinação de técnicas poderosas, auxiliadas por uma metodologia altamente rigorosa na preparação de substratos e aquisição de dados, torna a análise de EV profunda, definitiva e robusta.
O princípio da abordagem proposta é preparar um substrato de ouro, adsorver/enxertar ou capturar os subtipos de EV e digitalizá-los por AFM para estimar o tamanho e a morfologia de cada subconjunto de EV. Além disso, esses EVs adsorvidos são analisados por espectroscopia Raman. Esse substrato pode, de fato, apresentar três tipos de interfaces de complexidade crescente: microarrays nus, quimicamente funcionalizados ou ligantes. Antes de descrever as diferentes etapas do protocolo, os leitores são encaminhados para a apresentação esquemática da abordagem da plataforma nanobioanalítica (NBA) na Figura 1, combinando ressonância plasmônica de superfície (SPRi), AFM e espectroscopia.
Figura 1: A plataforma NanoBioAnalítica. A abordagem combina (A) ressonância plasmônica de superfície, (B) microscopia de força atômica e (nano)espectroscopia de infravermelho/Raman, todos engajados no mesmo substrato – um chip de ouro multiplexado. Abreviaturas: NBA = plataforma NanoBioAnalítica; SPRi = ressonância plasmônica de superfície; AFM = microscopia de força atômica; EV = vesícula extracelular. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O biochip de ouro principal constitui o coração da plataforma, uma vez que todas as técnicas de caracterização sem rótulo são conduzidas neste biochip. De acordo com as necessidades de caracterização do EV (global/total de EVs ou subconjuntos de EV) e as limitações/demandas dos métodos utilizados, três tipos de superfícies de biochip de ouro foram desenvolvidas: ou “nuas”, quimicamente funcionalizadas “C11/C16”, ou ligantes-biofuncionalizadas, chamadas de superfície de ouro “ligante”.
O biochip nu, chamado de “nu“, permite a simples adsorção de EVs em ouro. É possível selecionar o tampão utilizado e realizar essa adsorção de forma passiva (etapas de incubação e depois enxágue) ou monitorá-lo sob fluxo (em SPRi). Além disso, essa adsorção passiva pode ser realizada em todo o chip (como um macroarray) ou localizada em microarrays usando um spotter de micropipeta. O “procedimento sob fluxo” permite que os investigadores acompanhem a cinética e o nível de adsorção do EV. Essa abordagem no substrato de ouro nu é adotada quando a interface da camada química pode interferir no método analítico (por exemplo, para espectroscopia Raman).
O biochip quimicamente funcionalizado, chamado “C11/C16“, é usado para criar um “tapete” denso e robusto de EVs covalentemente ligados na superfície do ouro, formando ligações amidas primárias com os tiolatos quando o objetivo é ter uma visão global da amostra de EV. De fato, neste caso, o ouro é funcionalizado por uma mistura de tiolato de mercapto-1-undecanol (11-MUOH: “C11”) e ácido mercapto-1-hexadecanóico (16-MHA: “C16”), e uma fração dos tiolatos é quimicamente ativada para estabelecer ligação covalente com os alvos. Novamente, essa estratégia pode ser realizada passivamente (etapas de incubação e depois enxágue, seja em “macroarray” ou em vários microarrays usando um observador de micropipetas) ou sob taxas de fluxo (em SPRi) para seguir a cinética e o nível de enxerto de EV na superfície de ouro.
O biochip biofuncionalizado por ligante, chamado de “ligantes“, é quimicamente ativado para enxertar covalentemente diferentes ligantes (por exemplo, anticorpos, receptores) para capturar seletivamente (com afinidade) diferentes subconjuntos de EV que coexistem na amostra biológica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos recentes para identificação de EV que são os mais amplamente utilizados são imunoblotting específico de proteína para confirmar a origem de EVs, TEM para confirmar sua estrutura e NTA para quantificar seu número e distribuição de tamanho em um volume de amostra3. No entanto, o alto interesse em VEs em pesquisa (bio)médica e as limitações das ferramentas analíticas existentes levaram a comunidade científica a desenvolver novos métodos para caracterização, discriminaçã…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kelly Aubertin e Fabien Picot, da instalação central do IVETh (Paris), são reconhecidas pelos experimentos de imagem Raman. Thierry Burnouf (Taipei Medical University, Taiwan) e Zuzana Krupova (de Helincourt, França) são reconhecidos por fornecer as amostras de EV derivadas de amostras de plaquetas sanguíneas e leite bovino, respectivamente. O trabalho foi apoiado pela região de Bourgogne Franche-Comté e pela escola de pós-graduação EUR EIPHI (projeto NOVICE, 2021-2024). Parte deste trabalho foi feito usando a plataforma CLIPP e nas instalações de sala limpa da RENATECH na FEMTO-ENGINEERING, pelas quais agradecemos a Rabah Zeggari.
Materials
| CD41a antibody | Diaclone SAS (France) | 447528 | |
| CP920 | Microparticles GmbH, Germany | 448303 | |
| DXR3xi | Thermo Fisher Scientific | T1502 | |
| EDC | Sigma | A6272 | |
| Ethanolamine | Sigma | P5368-10PAK | |
| Evs derived from platelet concentrates | Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei) | S2889 | |
| Evs from bovine milk | Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt – France) | 3450 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 56845 | |
| Gwyddion | 853.223.020 | ||
| Magnetron sputtering | PLASSYS | SAB5300165 | |
| mercapto-1-hexadecanoic acid | Sigma | G5882 | |
| Mercapto-1-undecanol | Sigma | O8001 | |
| Mountains SPIP ones | Digital Surf | ||
| NanoWizard 3 Bioscience | Bruker-JPK | ||
| Octyl Glucoside (OG) | Sigma | ||
| Ovalbumine antibody | Sigma | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | ||
| Rat Albumin Serum (RSA) | Sigma | ||
| Sodium acetate buffer | Sigma | ||
| SPR-Biacore 3000 | GE Healthcare/ Cytiva life sciences | ||
| SPRi Biochip | MIMENTO technology platform | The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon | |
| SPRi Plex II | Horiba Scientific | ||
| Sulfo-NHS | Sigma |
References
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