В данной работе предлагается новое поколение многопараметрических аналитических платформ с повышенной пропускной способностью для характеристики подмножеств внеклеточных везикул. Метод основан на сочетании мультиплексных методов биозондирования с метрологическим и морфомеханическим анализом методом атомно-силовой микроскопии в сочетании с рамановской спектроскопией для квалификации везикулярных мишеней, захваченных на микрочипе.
Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой мембранные, крошечные везикулы, продуцируемые всеми клетками, которые варьируются от 50 до нескольких сотен нанометров в диаметре и используются в качестве средства межклеточной коммуникации. Они становятся многообещающими диагностическими и терапевтическими инструментами для лечения различных заболеваний. Существует два основных процесса биогенеза, используемых клетками для производства EV с различиями в размере, составе и содержании. Из-за их высокой сложности по размеру, составу и происхождению клеток их характеристика требует сочетания аналитических методов. Данный проект предполагает разработку нового поколения многопараметрических аналитических платформ с повышенной пропускной способностью для характеризации субпопуляций электромобилей. Для достижения этой цели работа начинается с созданной группой нанобиоаналитической платформы (NBA), которая позволяет проводить оригинальные исследования электромобилей на основе комбинации мультиплексных методов биозондирования с метрологическим и морфомеханическим анализом методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) везикулярных мишеней, захваченных на микрочипе. Цель состояла в том, чтобы завершить это исследование EV фенотипическим и молекулярным анализом с помощью рамановской спектроскопии. Эти разработки позволяют предложить мультимодальное и простое в использовании аналитическое решение для дискриминации подмножеств EV в биологических жидкостях с клиническим потенциалом
Растущий интерес к исследованиям электромобилей в диагностике и терапии 1,2,3,4,5 в сочетании с проблемами, с которыми сталкивается эта область, привел к разработке и внедрению большого разнообразия подходов и методов для количественной оценки или характеристики этих везикул. Наиболее широко используемыми методами идентификации EV являются белково-специфический иммуноблоттинг и протеомика для подтверждения происхождения EV, просвечивающая электронная микроскопия (TEM) для подтверждения их структуры и анализ отслеживания наночастиц (NTA) для количественной оценки их количества и распределения по размерам в объеме образца.
Однако ни один из этих методов сам по себе не дает всей информации, необходимой для характеристики подмножеств электромобилей. Присущая электромобилям гетерогенность из-за разнообразия их биохимических и физических свойств препятствует глобальному анализу, который является надежным и воспроизводимым, особенно для электромобилей, содержащихся в смеси (сыром образце). Таким образом, методы обнаружения и определения характеристик необходимы для электромобилей, как индивидуально, так и в целом, чтобы дополнить другие методы, которые являются более быстрыми, но не селективными6.
Визуализация с высоким разрешением с помощью ПЭМ (или криоТЕМ) или АСМ позволяет определять морфологию и метрологию электромобилей с нанометровым разрешением 7,8,9,10,11,12. Однако основным ограничением использования электронной микроскопии для биологических объектов, таких как EV, является необходимость вакуума для проведения исследования, которое требует фиксации и обезвоживания образца. Такая подготовка затрудняет перевод от наблюдаемых структур к морфологии EV в растворе. Чтобы избежать такого обезвоживания образца, метод криоТЭМ является наиболее подходящим для характеристики ЭВ13. Он широко используется для определения ультраструктуры электромобилей. Иммуномаркировка везикул биофункционализированными наночастицами золота также позволяет идентифицировать специфические субпопуляции ЭВ и отличать их от других частиц, присутствующих в сложном биологическом образце. Однако из-за небольшого количества электромобилей, анализируемых с помощью электронной микроскопии, часто бывает трудно выполнить характеристику, репрезентативную для сложного и неоднородного образца.
Чтобы выявить эту гетерогенность размеров, Международное общество внеклеточных везикул (ISEV) предлагает проанализировать достаточное количество широкопольных изображений, сопровождаемых изображениями меньшего размера, чтобы выявить отдельные EV с высоким разрешением14. АСМ является альтернативой оптическим подходам и электронным дифракционным методам для исследования электромобилей. В этом методе используется острый наконечник, удерживаемый гибким консолью, который сканирует образец, нанесенный на одну опору, строка за линией, и регулирует расстояние между наконечником и присутствующими элементами через петлю обратной связи. Это позволяет охарактеризовать топографию образца и собрать морфомеханическую информацию15,16,17,18. EV могут быть отсканированы с помощью AFM либо после осаждения на атомарно плоской подложке, либо после захвата на специфический субстрат, функционализированный антителами, пептидами или аптамерами, для характеристики различных субпопуляций18,19. Благодаря своей способности количественно определять и одновременно исследовать структуру, биомеханику и мембранное биомолекулярное содержание электромобилей в сложных биологических образцах без необходимости предварительной обработки, маркировки или обезвоживания, АСМ в настоящее время все чаще используется для точной и многопараметрической характеристики электромобилей в физиологических условиях температуры и среды.
В данной работе предложена методология с использованием основного золотого биочипа, способного к (био)химической функционализации в мультиплексированном формате. Этот субстрат является краеугольным камнем мощной аналитической платформы, объединяющей биообнаружение подмножеств EV с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и после того, как EV адсорбированы / привиты или иммунозахвачены на чипе, AFM позволяет метрологические и морфомеханические характеристики EV. В сочетании с рамановской сигнатурой подмножеств EV, захваченных на чипе, эта аналитическая платформа позволяет квалифицировать EV, присутствующие в биологических образцах, без меток и без необходимости в преаналитических этапах. В этой статье показано, что сочетание мощных методов, подкрепленных очень строгой методологией подготовки субстрата и сбора данных, делает анализ EV глубоким, окончательным и надежным.
Принцип предлагаемого подхода заключается в приготовлении золотого субстрата, адсорбции/трансплантации или захвате подтипов EV и сканировании их с помощью AFM для оценки размера и морфологии каждого подмножества EV. Кроме того, эти адсорбированные электромобили анализируются с помощью рамановской спектроскопии. Этот субстрат действительно может представлять три типа интерфейсов растущей сложности: голые, химически функционализированные или лигандные микрочипы. Прежде чем описывать различные этапы протокола, читатели могут обратиться к схематическому представлению подхода нанобиоаналитической платформы (NBA) на рисунке 1, сочетающего поверхностную плазмонно-резонансную томографию (SPRi), АСМ и спектроскопию.
Рисунок 1: Платформа NanoBioAnalytical. Этот подход сочетает в себе (A) поверхностно-плазмонно-резонансную томографию, (B) атомно-силовую микроскопию и инфракрасную/рамановскую (нано)спектроскопию, которые выполняются на одной и той же подложке – мультиплексированном золотом чипе. Сокращения: NBA = NanoBioAnalytical platform; SPRi = поверхностно-плазмонно-резонансная томография; АСМ = атомно-силовая микроскопия; EV = внеклеточный везикула. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Основной золотой биочип является сердцем платформы, поскольку на этом биочипе проводятся все методы определения характеристик без меток. В соответствии с потребностями характеристики EV (либо глобальные/общие EV, либо подмножества EV) и ограничениями/требованиями используемых методов, были разработаны три типа поверхностей золотых биочипов: либо «голые», химически функционализированные «C11/C16», либо лигандно-биофункционализированные, называемые «лигандной» золотой поверхностью.
Голый биочип, называемый «голым», обеспечивает простую адсорбцию электромобилей на золоте. Можно выбрать используемый буфер и реализовать эту адсорбцию либо пассивным способом (этапы инкубации и последующей промывки), либо контролировать его под потоком (в SPRi). Более того, эта пассивная адсорбция может быть реализована либо на всем чипе (в виде макрочипа), либо локализована в микрочипах с помощью микропипетки-споттера. «Процедура под потоком» позволяет исследователям следить за кинетикой и уровнем адсорбции EV. Этот подход на голой золотой подложке применяется, когда граница раздела химического слоя может мешать аналитическому методу (например, для рамановской спектроскопии).
Химически функционализированный биочип, называемый «C11 / C16», используется для создания плотного и прочного «ковра» из EV, ковалентно связанных на поверхности золота, путем образования первичных амидных связей с тиолатами, когда цель состоит в том, чтобы иметь глобальное представление об образце EV. Действительно, в этом случае золото функционализируется тиолатной смесью меркапто-1-ундеканола (11-MUOH: «C11») и меркапто-1-гексадекановой кислоты (16-MHA: «C16»), а часть тиолатов химически активируется для установления ковалентного связывания с мишенями. Опять же, эта стратегия может быть реализована либо пассивно (этапы инкубации, а затем промывки, либо в «макромассиве», либо в нескольких микрочипах с использованием микропипетки-споттера), либо при низких скоростях потока (в SPRi), чтобы следить за кинетикой и уровнем прививки EV на поверхности золота.
Лиганд-биофункционализированный биочип, называемый «лигандами», химически активируется для ковалентного трансплантата различных лигандов (например, антител, рецепторов) для селективного захвата (с аффинностью) различных подмножеств EV, которые сосуществуют в биологическом образце.
Наиболее широко используемыми методами идентификации ВВ являются белково-специфический иммуноблоттинг для подтверждения происхождения ВВ, ПЭМ для подтверждения их структуры и НТА для количественной оценки их количества и распределения по размерам в объемеобразца 3. Тем…
The authors have nothing to disclose.
Келли Обертен (Kelly Aubertin) и Фабьен Пико (Fabien Picot) из основного центра IVETh (Париж) получили признание за эксперименты по рамановской визуализации. Тьерри Бурнуф (Тайбэйский медицинский университет, Тайвань) и Зузана Крупова (из Хелинкура, Франция) получили признание за предоставление образцов EV, полученных из образцов тромбоцитов крови и бычьего молока соответственно. Работа была поддержана регионом Бургундия Франш-Конте и аспирантурой EUR EIPHI (проект NOVICE, 2021-2024). Часть этой работы была выполнена с использованием платформы CLIPP и в чистых помещениях RENATECH в FEMTO-ENGINEERING, за что мы благодарим Рабаха Зеггари.
CD41a antibody | Diaclone SAS (France) | 447528 | |
CP920 | Microparticles GmbH, Germany | 448303 | |
DXR3xi | Thermo Fisher Scientific | T1502 | |
EDC | Sigma | A6272 | |
Ethanolamine | Sigma | P5368-10PAK | |
Evs derived from platelet concentrates | Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei) | S2889 | |
Evs from bovine milk | Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt – France) | 3450 | |
Glutaraldehyde | Sigma | 56845 | |
Gwyddion | 853.223.020 | ||
Magnetron sputtering | PLASSYS | SAB5300165 | |
mercapto-1-hexadecanoic acid | Sigma | G5882 | |
Mercapto-1-undecanol | Sigma | O8001 | |
Mountains SPIP ones | Digital Surf | ||
NanoWizard 3 Bioscience | Bruker-JPK | ||
Octyl Glucoside (OG) | Sigma | ||
Ovalbumine antibody | Sigma | ||
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | ||
Rat Albumin Serum (RSA) | Sigma | ||
Sodium acetate buffer | Sigma | ||
SPR-Biacore 3000 | GE Healthcare/ Cytiva life sciences | ||
SPRi Biochip | MIMENTO technology platform | The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon | |
SPRi Plex II | Horiba Scientific | ||
Sulfo-NHS | Sigma |