Этот протокол описывает высокопроизводительный рабочий процесс для сегментации на основе искусственного интеллекта интересующих областей, подтвержденных патологией, из окрашенных изображений тонких участков тканей для обогащения популяций клеток с гистологическим разрешением с использованием лазерной микродиссекции. Эта стратегия включает в себя новый алгоритм, позволяющий передавать демаркации, обозначающие интересующие клеточные популяции, непосредственно на лазерные микроскопы.
Микроокружение опухоли (TME) представляет собой сложную экосистему, состоящую из десятков различных типов клеток, включая опухоли, стромы и популяции иммунных клеток. Чтобы охарактеризовать вариации протеомного уровня и гетерогенность опухоли в масштабе, необходимы высокопроизводительные методы для селективной изоляции дискретных клеточных популяций при злокачественных новообразованиях солидных опухолей. Этот протокол описывает высокопроизводительный рабочий процесс, обеспечиваемый искусственным интеллектом (ИИ), который сегментирует изображения окрашенных гематоксилином и эозином (H & E), тонких участков тканей в подтвержденные патологией области, представляющие интерес для селективного сбора популяций клеток с гистологическим разрешением с использованием лазерной микродиссекции (LMD). Эта стратегия включает в себя новый алгоритм, позволяющий передавать области, обозначающие интересующие клеточные популяции, аннотированные с помощью программного обеспечения для цифровых изображений, непосредственно в лазерные микроскопы, что позволяет более легко собирать данные. Была выполнена успешная реализация этого рабочего процесса, демонстрирующая полезность этого гармонизированного метода для селективного сбора популяций опухолевых клеток из TME для количественного, мультиплексированного протеомного анализа с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения. Эта стратегия полностью интегрируется с рутинным обзором гистопатологии, используя анализ цифровых изображений для поддержки обогащения интересующих клеточных популяций и является полностью обобщаемой, что позволяет гармонизировать сбор клеточных популяций из TME для многоомного анализа.
TME представляет собой сложную экосистему, населенную очень разнообразным набором типов клеток, таких как опухолевые клетки, стромальные клетки, иммунные клетки, эндотелиальные клетки, другие типы мезенхимальных клеток и адипоциты, наряду со сложным внеклеточным матриксом1. Эта клеточная экосистема варьируется внутри и между различными участками органов заболевания, что приводит к сложной гетерогенности опухоли 2,3. Недавние исследования показали, что гетерогенные опухоли и опухоли с низкой клеточностью опухоли (низкой чистотой) часто коррелируют с плохим прогнозом заболевания 2,3.
Чтобы понять молекулярное взаимодействие между популяциями опухолевых и неопухолевых клеток в пределах TME в масштабе, стандартизированные и высокопроизводительные стратегии необходимы для селективного сбора различных клеточных популяций, представляющих интерес для последующего многоомного анализа. Количественная протеомика представляет собой быстро развивающийся и все более важный метод для дальнейшего понимания биологии рака. На сегодняшний день преобладание исследований, использующих протеомику, сделало это с белками, извлеченными из цельных препаратов опухолевой ткани (например, криопульверизированными), что привело к скудности в понимании гетерогенности протеомного уровня в TME 4,5,6.
Разработка стратегий сбора образцов, которые легко интегрируются и используют информацию из рабочих процессов клинической патологии, позволит создать новое поколение протеомики с гистологическим разрешением, которые в значительной степени дополняют рабочие процессы диагностической патологии золотого стандарта. LMD обеспечивает прямой и селективный сбор клеточных субпопуляций или областей, представляющих интерес (ROI), путем микроскопического обследования гистологически окрашенных тонких участковткани 7. Недавние крупные достижения в области цифровой патологии и анализа с поддержкой ИИ продемонстрировали способность автоматически идентифицировать уникальные композиционные особенности и ROI в TME, многие из которых коррелируют с молекулярными изменениями и клиническими особенностями заболевания, такими как устойчивость к терапии и прогноз заболевания8.
Рабочий процесс, описанный в протоколе, представленном здесь, использует коммерческие программные решения для выборочной аннотации ROI опухоли в цифровых гистопатологических изображениях и использует программные инструменты, разработанные собственными силами для передачи этих ОПУХОЛЕВЫХ ROI на лазерные микроскопы для автоматизированного сбора дискретных клеточных популяций, представляющих интерес, который легко интегрируется с последующими рабочими процессами мультиомного анализа. Эта интегрированная стратегия значительно сокращает время оператора LMD и сводит к минимуму продолжительность, в течение которой ткани должны находиться при температуре окружающей среды. Интеграция автоматизированного отбора признаков и сбора LMD с высокопроизводительной количественной протеомикой демонстрируется путем дифференциального анализа TME из двух репрезентативных гистологических подтипов эпителиального рака яичников: высокодифференцированного серозного рака яичников (HGSOC) и прозрачно-клеточной карциномы яичников (OCCC).
Несмотря на то, что существует множество прецедентов исследований, направленных на разработку и/или совершенствование рабочих процессов обогащения целевых клеточных субпопуляций из FFPE и/или свежезамороженных тканей, а также методологий поддержания качества образцов во время обработки 9,12,13,14,15, существует существенная потребность в разработке автоматизированных стратегий подготовки образцов клинических тканей к молекулярному анализу для снижения изменчивости и повысить воспроизводимость. Этот рабочий процесс описывает стандартизированный, полуавтоматизированный протокол, который интегрирует существующие программные инструменты анализа изображений (см. Таблицу материалов) для сбора дискретных клеточных популяций с гистологическим разрешением с помощью LMD из образцов клинических тканей.
Пространственно-разрешенное обогащение LMD ROI, захватывающее дискретные клеточные популяции, представляет собой этап обработки тканей следующего поколения до многоомного анализа для улучшения молекулярной характеристики и идентификации и облегчения обнаружения селективных биомаркеров. Этот протокол улучшает существующие методологии, уменьшая часто длительное воздействие участков тканей на окружающую среду, что связано с ручной сегментацией ROI гистологом (что может занять >1-2 ч до сбора LMD). Вместо этого этот рабочий процесс позволяет предварительно идентифицировать ROI с помощью классификации и сегментации под руководством ИИ. Ограничение времени пребывания тканей уменьшит ложные вариации в оценках высоколабильных молекулярных мишеней, таких как фосфопептиды и мРНК, или для аналитических методов на основе антител, которые полагаются на то, что целевой белок находится в своей нативной конформации для обнаружения.
Вырезание аккуратных фидуциалов калибратора на слайде мембраны PEN, которые хорошо видны на отсканированном изображении слайда, является одним из ключевых компонентов, обеспечивающих интеграцию программного обеспечения для анализа изображений (см. Таблицу материалов) с рабочим процессом LMD. Обеспечение того, чтобы калибраторы имели точную («чистую») точку в нижней части V-образной формы, позволяет выбрать точную точку в программном обеспечении для анализа изображений для калибраторных линий, из которых должны быть взяты линии, как описано в шагах 5.1.6 и 5.2.13. Выравнивание этих точек во время импорта в программное обеспечение LMD имеет решающее значение для правильного наложения аннотаций (облегчается путем создания совместимого файла .xml с использованием алгоритмов «Malleator» и / или «Dapọ») на соответствующую рентабельность инвестиций в ткани на физическом слайде LMD. Необходимо выделить все формы и коллективно «перетащить» на место, даже если выравнивание точно при импорте в программное обеспечение LMD, чтобы зарегистрировать вертикальное (z-плоскостное) положение слайд-сцены на лазерном микроскопе. Незначительные корректировки в позиционировании аннотаций над ROI ткани также могут быть сделаны на этом этапе, если это необходимо.
Ограничение текущей версии алгоритма Malleator заключается в том, что он несовместим с предопределенными инструментами формы аннотаций, предоставляемыми программным обеспечением для анализа изображений (см. Таблицу материалов), хотя будущие обновления / версии алгоритма будут направлены на улучшение этой совместимости. Файл .annotation для фигур, нарисованных с помощью этих инструментов, содержит только два набора парных координат x и y для каждой аннотации без полной пространственной ориентации вокруг этих точек. Текущее использование этих инструментов приводит к тому, что аннотации преобразуются в прямые линии, определенные только двумя точками в процессе импорта. Ручное определение сегментов ROI ткани требуется для успешного преобразования в формат XML и импорта LMD. Это может быть выполнено либо путем ручного определения каждого ROI с индивидуальными полигональными аннотациями свободной руки, специфичными для целевой области, либо путем применения приближенной круговой или прямоугольной аннотации ко всем сегментам ROI ткани, если это необходимо, и будет совместимо с этим рабочим процессом.
В то время как рабочий процесс, представленный здесь, был продемонстрирован для протеомного анализа свежезамороженных образцов ткани рака человека, этот рабочий процесс LMD на основе ИИ может быть эквивалентно использован с тканями FFPE, нераковыми типами тканей и теми, которые получены из нечеловеческих источников. Он также может поддерживать другие последующие рабочие процессы молекулярного профилирования, включая транскриптомный, геномный или фосфопротеомный анализ. Этот рабочий процесс может также использовать другие виды использования программного обеспечения для анализа изображений (см. Таблицу материалов), в том числе с возможностями, связанными с подсчетом клеток или другими аналитическими модулями, включая модуль «Multiplex IHC» или «Дополнение тканевого микрочипа (TMA)». Будущие приложения этого рабочего процесса также могут извлечь выгоду из предварительного определения количества клеток на сегмент ROI, тем самым обеспечивая эквивалентные клеточные входы в нескольких коллекциях, или используя альтернативные методы определения клеточных ROI, представляющих интерес, такие как иммуногистохимия или клеточная социология.
The authors have nothing to disclose.
Финансирование этого проекта было частично предоставлено Программой оборонного здравоохранения (HU0001-16-2-0006 и HU0001-16-2-00014) Университету военных служб для Центра передового опыта гинекологического рака. Спонсоры не играли никакой роли в разработке, исполнении, интерпретации или написании исследования. Отказ: Мнения, выраженные в настоящем документе, являются мнениями авторов и не отражают официальную политику Министерства армии/флота/ВОЕННО-воздушных сил, Министерства обороны или Правительства США.
1260 Infinity II System | Agilent Technologies Inc | Offline LC system | |
96 MicroCaps (150uL) in bulk | Pressure Biosciences Inc | MC150-96 | |
96 MicroPestles in bulk | Pressure Biosciences Inc | MP-96 | |
96 MicroTubes in bulk (no caps) | Pressure Biosciences Inc | MT-96 | |
9mm MS Certified Clear Screw Thread Kits | Fisher Scientific | 03-060-058 | Sample vial for offline LC frationation and mass spectrometry |
Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A995-4 | Mobile phase solvent |
Aperio AT2 | Leica Microsystems | 23AT2100 | Slide scanner |
Axygen PCR Tubes with 0.5 mL Flat Cap | Fisher Scientific | 14-222-292 | Sample tubes; size fits PCT tubes and thermocycler |
Barocycler 2320EXT | Pressure Biosciences Inc | 2320-EXT | Barocycler |
BCA Protein Assay Kit | Fisher Scientific | P123225 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
Easy-nLC 1200 | Thermo Fisher Scientific | Liquid Chromatography | |
EasyPep Maxi Sample Prep Kit | Thermo Fisher Scientific | NCI5734 | Post-label sample clean up column |
EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75 | Fisher Scientific | ES903 | Analytical column |
Eosin Y Solution Aqueous | Sigma Aldrich | HT110216 | |
Formic Acid, 99+ % | Thermo Fisher Scientific | 28905 | Mobile phase additive |
ggplot2 version 3.3.5 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/ | |
HALO | Indica Labs | Image analysis software | |
IDLE (Integrated Development and Learning Environment) | Python Software Foundation | ||
iheatmapr version 0.5.1 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/ | |
iRT Kit | Biognosys | Ki-3002-1 | LC-MS QAQC Standard |
limma version 3.42.2 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html | |
LMD Scanning stage Ultra LMT350 | Leica Microsystems | 11888453 | LMD stage model outfitted with PCT tube holder |
LMD7 (software version 8.2.3.7603) | Leica Microsystems | LMD apparatus (microscope, laser, camera, PC, tablet) | |
Mascot Server | Matrix Science | Data analysis software | |
Mass Spec-Compatible Human Protein Extract, Digest | Promega | V6951 | LC-MS QAQC Standard |
Mayer’s Hematoxylin Solution | Sigma Aldrich | MHS32 | |
PEN Membrane Glass Slides | Leica Microsystems | 11532918 | |
Peptide Retention Time Calibration Mixture | Thermo Fisher Scientific | 88321 | LC-MS QAQC Standard |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma Aldrich | P5726 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma Aldrich | P0044 | |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | Instrument calibration solution |
PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK | Fisher Scientific | 164535 | Pre-column |
Proteome Discoverer | Thermo Fisher Scientific | OPTON-31040 | Data analysis software |
Python | Python Software Foundation | ||
Q Exactive HF-X | Thermo Fisher Scientific | Mass spectrometer | |
R version 3.6.0 | CRAN | https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/ | |
RColorBrewer version 1.1-2 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/ | |
Soluble Smart Digest Kit | Thermo Fisher Scientific | 3251711 | Digestion reagent |
TMTpro 16plex Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | A44520 | isobaric TMT labeling reagents |
Veriti 60 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4384638 | Thermocycler |
Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | W6-4 | Mobile phase solvent |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 12.5 mm, 5 µm, guard cartridge (ZGC) | Agilent Technologies Inc | 821125-932 | Offline LC trap column |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 150 mm, 3.5 µm | Agilent Technologies Inc | 763750-902 | Offline LC analytical column |