该协议描述了一种高通量工作流程,用于人工智能驱动的从染色的薄组织切片图像中分割病理确认感兴趣的区域,以使用激光显微切割富集组织学分辨细胞群。该策略包括一种新颖的算法,能够将表示感兴趣细胞群的分界线直接转移到激光显微镜上。
肿瘤微环境(TME)代表了一个由数十种不同细胞类型组成的复杂生态系统,包括肿瘤,基质和免疫细胞群。为了大规模表征蛋白质组水平的变化和肿瘤异质性,需要高通量方法来选择性地分离实体瘤恶性肿瘤中的离散细胞群。该协议描述了一种由人工智能(AI)实现的高通量工作流程,该工作流程将苏木精和曙红(H&E)染色的薄组织切片的图像分割成病理学确认的感兴趣区域,以便使用激光显微切割(LMD)选择性收获组织学分辨细胞群。该策略包括一种新颖的算法,能够将表示感兴趣细胞群的区域直接转移到激光显微镜上,从而能够更轻松地收集,使用数字图像软件进行注释。成功实施了该工作流程,证明了这种协调方法的实用性,该方法可通过高分辨率质谱选择性地从TME中收获肿瘤细胞群,以进行定量,多路复用蛋白质组学分析。该策略与常规组织病理学检查完全集成,利用数字图像分析来支持感兴趣的细胞群的富集,并且是完全可推广的,能够从TME中协调收获细胞群以进行多组分析。
TME代表了一个复杂的生态系统,由高度多样化的细胞类型阵列组成,例如肿瘤细胞,基质细胞,免疫细胞,内皮细胞,其他间充质细胞类型和脂肪细胞,以及复杂的细胞外基质1。这种细胞生态系统在不同疾病器官部位内和之间变化,导致复杂的肿瘤异质性2,3。最近的研究表明,异质性肿瘤和肿瘤细胞性低(低纯度)的肿瘤通常与不良的疾病预后相关2,3。
为了大规模了解TME内肿瘤和非肿瘤细胞群之间的分子相互作用,需要标准化和高通量策略来选择性地收获感兴趣的不同细胞群以进行下游多组分析。定量蛋白质组学代表了一种快速发展和日益重要的技术,以进一步了解癌症生物学。迄今为止,采用蛋白质组学的大多数研究已经使用从整个肿瘤组织制剂中提取的蛋白质(例如,冷冻粉碎)来做到这一点,导致对TME4,5,6中蛋白质组水平异质性的理解不足。
与临床病理学工作流程无缝集成和利用信息的样本收集策略的开发将使新一代组织学解决的蛋白质组学成为可能,这些蛋白质组学与金标准,诊断病理学工作流程高度互补。LMD能够通过对组织学染色的组织薄切片进行显微镜检查,直接和选择性地收集细胞亚群或感兴趣区域(ROI)7。数字病理学和人工智能分析的最新重大进展已经证明能够以自动化方式识别TME内独特的组成特征和ROI,其中许多与分子改变和临床疾病特征相关,例如对治疗的抵抗力和疾病预后8。
本文介绍的方案中描述的工作流程利用商业软件解决方案在数字组织病理学图像中选择性地注释肿瘤ROI,并利用内部开发的软件工具将这些肿瘤ROI传输到激光显微镜,以自动收集感兴趣的离散细胞群,与下游多组分析工作流程无缝集成。这种集成策略显著缩短了LMD操作员的时间,并最大限度地缩短了组织在环境温度下所需的时间。通过对两种代表性上皮性卵巢癌组织学亚型(高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)和卵巢透明细胞癌(OCCC))的TME进行差异分析,证明了自动特征选择和LMD收获与高通量定量蛋白质组学的整合。
虽然已有多个研究先例旨在开发和/或改进工作流程,以富集FFPE和/或新鲜冷冻组织中的目标细胞亚群以及在处理过程中保持样品质量的方法9,12,13,14,15,但仍迫切需要开发自动化策略来制备用于分子分析的临床组织标本,以减少变异性和 提高再现性。该工作流程描述了一种标准化的半自动方案,该方案集成了现有的图像分析软件工具(参见材料表),可通过LMD从临床组织标本中以组织学方式分离收获离散细胞群。
捕获离散细胞群的ROI的空间分辨LMD富集代表了多组学分析之前的下一代组织处理步骤,以改善分子表征和鉴定并促进细胞选择性生物标志物的发现。该协议通过减少组织切片经常长时间暴露于周围环境(与组织学家手动分割ROI相关的环境)(在LMD收集之前可能需要>1-2小时)来改进现有方法。相反,此工作流允许通过 AI 引导的分类和细分来预先确定 ROI。限制组织停留时间将减少高度不稳定的分子靶标(如磷酸肽和mRNA)评估中的虚假变化,或用于依赖于靶蛋白在其天然构象中的基于抗体的分析技术进行检测。
在扫描的载玻片图像中清晰可见的 PEN 膜载玻片上切割整齐的校准器基准是实现图像分析软件(参见 材料表)与 LMD 工作流程集成的关键组件之一。确保校准器在“V”形底部有一个精确(“干净”)的点,可以在图像分析软件中选择一个精确的点,以便从中绘制校准器线,如步骤5.1.6和5.2.13所述。在导入到LMD软件的过程中,这些点的对齐对于将注释(通过使用“Malleator”和/或“Dapọ”算法生成兼容的.xml文件)正确叠加到物理LMD载玻片上的相关组织ROI上至关重要。有必要突出显示所有形状,并集体“拖放”到位,即使导入LMD软件时对齐是精确的,以在激光显微镜上记录载玻片载物台的垂直(z平面)位置。如果需要,也可以在此步骤中对组织ROI上的注释位置进行微小调整。
当前版本的 Malleator 算法的局限性在于它与图像分析软件提供的预定义注释形状工具不兼容(参见 材料表),尽管该算法的未来更新/版本将旨在提高这种兼容性。使用这些工具绘制的形状的 .annotation 文件对于每个注记仅包含两组成对的 x 和 y 坐标,而没有围绕这些点的完整空间方向。目前使用这些工具会导致注释在导入过程中转换为仅由两个点定义的直线。要成功转换为 XML 格式和 LMD 导入,需要手动定义组织 ROI 段。这可以通过手动定义每个ROI来执行,方法是使用特定于目标区域的单个徒手多边形注释,或者如果需要,可以在所有组织ROI段上应用近似的圆形或矩形注释,并且与此工作流程兼容。
虽然这里介绍的工作流程被证明用于新鲜冷冻的人类癌症组织标本的蛋白质组学分析,但这种AI驱动的LMD工作流程可以等效地用于FFPE组织,非癌组织类型以及来自非人类来源的组织类型。它还可以支持其他下游分子分析工作流程,包括转录组学、基因组学或磷酸化蛋白质组学分析。该工作流程还可以利用图像分析软件的其他用途(参见 材料表),包括与细胞计数或其他分析模块相关的功能,包括“多重IHC”模块或“组织微阵列(TMA)附加组件”。该工作流程的未来应用也可能受益于预定义每个ROI片段的细胞数量,从而确保多个集合之间的等效细胞输入,或者通过使用替代方法来定义感兴趣的细胞ROI,例如免疫组化或细胞社会学。
The authors have nothing to disclose.
该项目的资金部分由国防健康计划(HU0001-16-2-0006和HU0001-16-2-00014)提供给统一服务大学妇科癌症卓越中心。申办方在研究的设计、执行、解释或撰写中没有任何作用。 免責聲明: 本文表达的观点是作者的观点,并不反映陆军/海军/空军部,国防部或美国政府的官方政策。
1260 Infinity II System | Agilent Technologies Inc | Offline LC system | |
96 MicroCaps (150uL) in bulk | Pressure Biosciences Inc | MC150-96 | |
96 MicroPestles in bulk | Pressure Biosciences Inc | MP-96 | |
96 MicroTubes in bulk (no caps) | Pressure Biosciences Inc | MT-96 | |
9mm MS Certified Clear Screw Thread Kits | Fisher Scientific | 03-060-058 | Sample vial for offline LC frationation and mass spectrometry |
Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A995-4 | Mobile phase solvent |
Aperio AT2 | Leica Microsystems | 23AT2100 | Slide scanner |
Axygen PCR Tubes with 0.5 mL Flat Cap | Fisher Scientific | 14-222-292 | Sample tubes; size fits PCT tubes and thermocycler |
Barocycler 2320EXT | Pressure Biosciences Inc | 2320-EXT | Barocycler |
BCA Protein Assay Kit | Fisher Scientific | P123225 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
Easy-nLC 1200 | Thermo Fisher Scientific | Liquid Chromatography | |
EasyPep Maxi Sample Prep Kit | Thermo Fisher Scientific | NCI5734 | Post-label sample clean up column |
EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75 | Fisher Scientific | ES903 | Analytical column |
Eosin Y Solution Aqueous | Sigma Aldrich | HT110216 | |
Formic Acid, 99+ % | Thermo Fisher Scientific | 28905 | Mobile phase additive |
ggplot2 version 3.3.5 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/ | |
HALO | Indica Labs | Image analysis software | |
IDLE (Integrated Development and Learning Environment) | Python Software Foundation | ||
iheatmapr version 0.5.1 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/ | |
iRT Kit | Biognosys | Ki-3002-1 | LC-MS QAQC Standard |
limma version 3.42.2 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html | |
LMD Scanning stage Ultra LMT350 | Leica Microsystems | 11888453 | LMD stage model outfitted with PCT tube holder |
LMD7 (software version 8.2.3.7603) | Leica Microsystems | LMD apparatus (microscope, laser, camera, PC, tablet) | |
Mascot Server | Matrix Science | Data analysis software | |
Mass Spec-Compatible Human Protein Extract, Digest | Promega | V6951 | LC-MS QAQC Standard |
Mayer’s Hematoxylin Solution | Sigma Aldrich | MHS32 | |
PEN Membrane Glass Slides | Leica Microsystems | 11532918 | |
Peptide Retention Time Calibration Mixture | Thermo Fisher Scientific | 88321 | LC-MS QAQC Standard |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma Aldrich | P5726 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma Aldrich | P0044 | |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | Instrument calibration solution |
PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK | Fisher Scientific | 164535 | Pre-column |
Proteome Discoverer | Thermo Fisher Scientific | OPTON-31040 | Data analysis software |
Python | Python Software Foundation | ||
Q Exactive HF-X | Thermo Fisher Scientific | Mass spectrometer | |
R version 3.6.0 | CRAN | https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/ | |
RColorBrewer version 1.1-2 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/ | |
Soluble Smart Digest Kit | Thermo Fisher Scientific | 3251711 | Digestion reagent |
TMTpro 16plex Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | A44520 | isobaric TMT labeling reagents |
Veriti 60 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4384638 | Thermocycler |
Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | W6-4 | Mobile phase solvent |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 12.5 mm, 5 µm, guard cartridge (ZGC) | Agilent Technologies Inc | 821125-932 | Offline LC trap column |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 150 mm, 3.5 µm | Agilent Technologies Inc | 763750-902 | Offline LC analytical column |