Questo protocollo descrive un flusso di lavoro ad alto rendimento per la segmentazione guidata dall’intelligenza artificiale delle regioni di interesse confermate dalla patologia da immagini di sezioni di tessuto sottile macchiate per l’arricchimento di popolazioni cellulari risolte in istologia utilizzando la microdissezione laser. Questa strategia include un nuovo algoritmo che consente il trasferimento di demarcazioni che denotano popolazioni cellulari di interesse direttamente ai microscopi laser.
Il microambiente tumorale (TME) rappresenta un ecosistema complesso composto da dozzine di tipi di cellule distinte, tra cui tumori, stroma e popolazioni di cellule immunitarie. Per caratterizzare la variazione del livello del proteoma e l’eterogeneità del tumore su larga scala, sono necessari metodi ad alto rendimento per isolare selettivamente popolazioni cellulari discrete in tumori maligni solidi. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro ad alto rendimento, abilitato dall’intelligenza artificiale (AI), che segmenta le immagini di sezioni di tessuto sottile colorate con ematossilina ed eosina (H & E) in regioni di interesse confermate dalla patologia per la raccolta selettiva di popolazioni cellulari risolte in istologia utilizzando la microdissezione laser (LMD). Questa strategia include un nuovo algoritmo che consente il trasferimento di regioni che denotano popolazioni cellulari di interesse, annotate utilizzando software di immagine digitale, direttamente ai microscopi laser, consentendo così raccolte più facili. È stata eseguita con successo l’implementazione di questo flusso di lavoro, dimostrando l’utilità di questo metodo armonizzato per raccogliere selettivamente le popolazioni di cellule tumorali dalla TME per l’analisi proteomica quantitativa e multiplexata mediante spettrometria di massa ad alta risoluzione. Questa strategia si integra pienamente con la revisione istopatologica di routine, sfruttando l’analisi delle immagini digitali per supportare l’arricchimento delle popolazioni cellulari di interesse ed è completamente generalizzabile, consentendo raccolte armonizzate di popolazioni cellulari dalla TME per analisi multiomiche.
La TME rappresenta un ecosistema complesso popolato da una gamma altamente diversificata di tipi di cellule, come cellule tumorali, cellule stromali, cellule immunitarie, cellule endoteliali, altri tipi di cellule mesenchimali e adipociti, insieme a una complessa matrice extracellulare1. Questo ecosistema cellulare varia all’interno e tra i diversi siti degli organi della malattia, con conseguente eterogeneità tumorale complessa 2,3. Studi recenti hanno dimostrato che tumori eterogenei e tumori con bassa cellularità tumorale (bassa purezza) spesso sono correlati con una prognosi sfavorevoledella malattia 2,3.
Per comprendere l’interazione molecolare tra popolazioni di cellule tumorali e non tumorali all’interno della TME su larga scala, sono necessarie strategie standardizzate e ad alto rendimento per raccogliere selettivamente distinte popolazioni cellulari di interesse per l’analisi multiomica a valle. La proteomica quantitativa rappresenta una tecnica in rapida evoluzione e sempre più importante per approfondire la comprensione della biologia del cancro. Ad oggi, la preponderanza di studi che impiegano la proteomica lo ha fatto con proteine estratte da interi preparati di tessuto tumorale (ad esempio, criopolverizzato), portando a una scarsità nella comprensione dell’eterogeneità a livello di proteoma nella TME 4,5,6.
Lo sviluppo di strategie di raccolta dei campioni che si integrano perfettamente e sfruttano le informazioni provenienti dai flussi di lavoro della patologia clinica consentiranno una nuova generazione di proteomica risolta in istologia che sono altamente complementari ai flussi di lavoro di patologia diagnostica gold standard. LMD consente la raccolta diretta e selettiva di sottopopolazioni cellulari o regioni di interesse (ROI) attraverso l’ispezione microscopica di sezioni sottili di tessuto istologicamente colorato7. I recenti importanti progressi nella patologia digitale e nell’analisi abilitata all’intelligenza artificiale hanno dimostrato la capacità di identificare caratteristiche compositive e ROI unici all’interno della TME in modo automatizzato, molti dei quali correlati con alterazioni molecolari e caratteristiche cliniche della malattia, come la resistenza alla terapia e la prognosi della malattia8.
Il flusso di lavoro descritto nel protocollo qui presentato sfrutta le soluzioni software commerciali per annotare selettivamente i ROI tumorali all’interno di immagini istopatologiche digitali e utilizza strumenti software sviluppati internamente per trasferire questi ROI tumorali ai microscopi laser per la raccolta automatizzata di popolazioni cellulari discrete di interesse che si integra perfettamente con i flussi di lavoro di analisi multiomica a valle. Questa strategia integrata riduce significativamente il tempo dell’operatore LMD e riduce al minimo la durata per la quale i tessuti devono essere a temperatura ambiente. L’integrazione della selezione automatizzata delle caratteristiche e della raccolta di LMD con la proteomica quantitativa ad alto rendimento è dimostrata attraverso un’analisi differenziale della TME da due sottotipi istologici rappresentativi di carcinoma ovarico epiteliale, carcinoma ovarico sieroso di alto grado (HGSOC) e carcinoma ovarico a cellule chiare (OCCC).
Sebbene vi siano stati diversi precedenti di studio volti a sviluppare e/o migliorare i flussi di lavoro per l’arricchimento di sottopopolazioni cellulari bersaglio da FFPE e/o tessuti freschi congelati e metodologie per mantenere la qualità del campione durante l’elaborazione 9,12,13,14,15, esiste una sostanziale necessità di sviluppare strategie automatizzate per la preparazione di campioni di tessuto clinico per analisi molecolari per ridurre la variabilità e aumentare la riproducibilità. Questo flusso di lavoro descrive un protocollo standardizzato e semiautomatico che integra gli strumenti software di analisi delle immagini esistenti (vedere la Tabella dei materiali) per la raccolta risolta in istologia di popolazioni cellulari discrete da LMD da campioni di tessuto clinico.
L’arricchimento LMD spazialmente risolto di ROI che catturano popolazioni cellulari discrete rappresenta una fase di elaborazione tissutale di prossima generazione prima delle analisi multiomiche per migliorare la caratterizzazione e l’identificazione molecolare e facilitare la scoperta di biomarcatori selettivi delle cellule. Questo protocollo migliora le metodologie esistenti riducendo l’esposizione spesso lunga delle sezioni di tessuto all’ambiente ambientale associata alla segmentazione manuale del ROI da parte di un istologo (che può richiedere >1-2 ore prima della raccolta LMD). Questo flusso di lavoro consente invece di preidentificare il ROI dalla classificazione e dalla segmentazione guidate dall’intelligenza artificiale. Limitare il tempo di permanenza nei tessuti ridurrà le variazioni spurie nelle valutazioni di bersagli molecolari altamente labili, come fosfopeptidi e mRNA, o per tecniche analitiche basate su anticorpi che si basano su una proteina bersaglio nella sua conformazione nativa per il rilevamento.
Il taglio di fiduciali di calibrazione puliti sul vetrino a membrana PEN che sono chiaramente visibili nell’immagine della diapositiva scansionata è uno dei componenti chiave che consentono l’integrazione del software di analisi delle immagini (vedere la Tabella dei materiali) con il flusso di lavoro LMD. Garantire che i calibratori abbiano un punto preciso (“pulito”) nella parte inferiore della forma a “V” consente di selezionare un punto preciso nel software di analisi delle immagini per le linee del calibratore da cui disegnare, come descritto nei passaggi 5.1.6 e 5.2.13. L’allineamento di questi punti durante l’importazione nel software LMD è fondamentale per sovrapporre correttamente le annotazioni (facilitato attraverso la generazione di un file .xml compatibile utilizzando gli algoritmi “Malleator” e/o “Dapọ”) sul ROI del tessuto pertinente sulla diapositiva LMD fisica. È necessario evidenziare tutte le forme e collettivamente “trascinare e rilasciare” in posizione anche quando l’allineamento è preciso al momento dell’importazione nel software LMD per registrare la posizione verticale (piano z) dello stadio del vetrino sul microscopio laser. Piccoli aggiustamenti al posizionamento delle annotazioni sul ROI del tessuto possono anche essere effettuati durante questa fase, se necessario.
Una limitazione della versione corrente dell’algoritmo Malleator è che non è compatibile con gli strumenti di forma di annotazione predefiniti forniti dal software di analisi delle immagini (vedere la Tabella dei materiali), sebbene i futuri aggiornamenti / versioni dell’algoritmo mireranno a migliorare questa compatibilità. Il file .annotation per le forme disegnate utilizzando questi strumenti contiene solo due set di coordinate x e y accoppiate per ogni annotazione, senza l’orientamento spaziale completo attorno a tali punti. L’uso corrente di questi strumenti comporta la conversione delle annotazioni in linee rette definite da soli due punti durante il processo di importazione. La definizione manuale dei segmenti roi dei tissue è necessaria per una conversione di successo in formato XML e l’importazione LMD. Questo può essere eseguito definendo manualmente ogni ROI con singole annotazioni poligonali a mano libera specifiche per l’area di destinazione o applicando un’annotazione circolare o rettangolare approssimata su tutti i segmenti di ROI del tessuto, se lo si desidera, e sarà compatibile con questo flusso di lavoro.
Mentre il flusso di lavoro qui presentato è stato dimostrato per l’analisi proteomica di campioni di tessuto tumorale umano appena congelati, questo flusso di lavoro LMD basato sull’intelligenza artificiale può essere utilizzato in modo equivalente con tessuti FFPE, tipi di tessuto non canceroso e quelli provenienti da fonti non umane. Può anche supportare altri flussi di lavoro di profilazione molecolare a valle, tra cui analisi trascrittomiche, genomiche o fosfoproteomiche. Questo flusso di lavoro può anche sfruttare altri usi del software di analisi delle immagini (vedere la Tabella dei materiali), anche con funzionalità associate al conteggio delle cellule o ad altri moduli analitici, tra cui il modulo “Multiplex IHC” o il “Tissue Microarray (TMA) Add-on”. Le applicazioni future di questo flusso di lavoro possono anche trarre vantaggio dalla predefinizione del numero di cellule per segmento ROI, garantendo così input cellulari equivalenti su più raccolte o utilizzando metodi alternativi per definire i ROI cellulari di interesse, come l’immunoistochimica o la sociologia cellulare.
The authors have nothing to disclose.
Il finanziamento per questo progetto è stato fornito in parte dal Defense Health Program (HU0001-16-2-0006 e HU0001-16-2-00014) alla Uniformed Services University per il Gynecologic Cancer Center of Excellence. Gli sponsor non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione, esecuzione, interpretazione o scrittura dello studio. Disconoscimento: Le opinioni qui espresse sono quelle degli autori e non riflettono la politica ufficiale del Dipartimento dell’Esercito/Marina/Aeronautica, del Dipartimento della Difesa o del Governo degli Stati Uniti.
1260 Infinity II System | Agilent Technologies Inc | Offline LC system | |
96 MicroCaps (150uL) in bulk | Pressure Biosciences Inc | MC150-96 | |
96 MicroPestles in bulk | Pressure Biosciences Inc | MP-96 | |
96 MicroTubes in bulk (no caps) | Pressure Biosciences Inc | MT-96 | |
9mm MS Certified Clear Screw Thread Kits | Fisher Scientific | 03-060-058 | Sample vial for offline LC frationation and mass spectrometry |
Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A995-4 | Mobile phase solvent |
Aperio AT2 | Leica Microsystems | 23AT2100 | Slide scanner |
Axygen PCR Tubes with 0.5 mL Flat Cap | Fisher Scientific | 14-222-292 | Sample tubes; size fits PCT tubes and thermocycler |
Barocycler 2320EXT | Pressure Biosciences Inc | 2320-EXT | Barocycler |
BCA Protein Assay Kit | Fisher Scientific | P123225 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
Easy-nLC 1200 | Thermo Fisher Scientific | Liquid Chromatography | |
EasyPep Maxi Sample Prep Kit | Thermo Fisher Scientific | NCI5734 | Post-label sample clean up column |
EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75 | Fisher Scientific | ES903 | Analytical column |
Eosin Y Solution Aqueous | Sigma Aldrich | HT110216 | |
Formic Acid, 99+ % | Thermo Fisher Scientific | 28905 | Mobile phase additive |
ggplot2 version 3.3.5 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/ | |
HALO | Indica Labs | Image analysis software | |
IDLE (Integrated Development and Learning Environment) | Python Software Foundation | ||
iheatmapr version 0.5.1 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/ | |
iRT Kit | Biognosys | Ki-3002-1 | LC-MS QAQC Standard |
limma version 3.42.2 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html | |
LMD Scanning stage Ultra LMT350 | Leica Microsystems | 11888453 | LMD stage model outfitted with PCT tube holder |
LMD7 (software version 8.2.3.7603) | Leica Microsystems | LMD apparatus (microscope, laser, camera, PC, tablet) | |
Mascot Server | Matrix Science | Data analysis software | |
Mass Spec-Compatible Human Protein Extract, Digest | Promega | V6951 | LC-MS QAQC Standard |
Mayer’s Hematoxylin Solution | Sigma Aldrich | MHS32 | |
PEN Membrane Glass Slides | Leica Microsystems | 11532918 | |
Peptide Retention Time Calibration Mixture | Thermo Fisher Scientific | 88321 | LC-MS QAQC Standard |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma Aldrich | P5726 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma Aldrich | P0044 | |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | Instrument calibration solution |
PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK | Fisher Scientific | 164535 | Pre-column |
Proteome Discoverer | Thermo Fisher Scientific | OPTON-31040 | Data analysis software |
Python | Python Software Foundation | ||
Q Exactive HF-X | Thermo Fisher Scientific | Mass spectrometer | |
R version 3.6.0 | CRAN | https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/ | |
RColorBrewer version 1.1-2 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/ | |
Soluble Smart Digest Kit | Thermo Fisher Scientific | 3251711 | Digestion reagent |
TMTpro 16plex Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | A44520 | isobaric TMT labeling reagents |
Veriti 60 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4384638 | Thermocycler |
Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | W6-4 | Mobile phase solvent |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 12.5 mm, 5 µm, guard cartridge (ZGC) | Agilent Technologies Inc | 821125-932 | Offline LC trap column |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 150 mm, 3.5 µm | Agilent Technologies Inc | 763750-902 | Offline LC analytical column |