פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה בתפוקה גבוהה לסגמנטציה מונחית בינה מלאכותית של אזורי עניין שאושרו על-ידי פתולוגיה מתמונות מוכתמות ודקות של מקטעי רקמה להעשרת אוכלוסיות תאים שנפתרו על-ידי היסטולוגיה באמצעות מיקרו-דיסקציה של לייזר. אסטרטגיה זו כוללת אלגוריתם חדשני המאפשר העברת תיחום המציין אוכלוסיות תאים בעלי עניין ישירות למיקרוסקופי לייזר.
המיקרו-סביבה של הגידול (TME) מייצגת מערכת אקולוגית מורכבת המורכבת מעשרות סוגי תאים מובחנים, כולל אוכלוסיות גידולים, סטרומה ותאי חיסון. כדי לאפיין את השונות ברמת הפרוטאום ואת ההטרוגניות של הגידול בקנה מידה גדול, יש צורך בשיטות בעלות תפוקה גבוהה כדי לבודד באופן סלקטיבי אוכלוסיות תאיות בדידות בממאירות של גידולים מוצקים. פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה בתפוקה גבוהה, המתאפשרת על ידי בינה מלאכותית (AI), המפלחת תמונות של חלקי רקמות דקים ומוכתמים בהמטוקסילין (H&E) ומוכתמים ב-Eosin (H&E) לאזורי עניין שאושרו על-ידי פתולוגיה לצורך קצירה סלקטיבית של אוכלוסיות תאים שנפתרו על-ידי היסטולוגיה באמצעות מיקרו-דיסקציה של לייזר (LMD). אסטרטגיה זו כוללת אלגוריתם חדשני המאפשר העברה של אזורים המציינים אוכלוסיות תאים בעלי עניין, מבוארים באמצעות תוכנת תמונה דיגיטלית, ישירות למיקרוסקופי לייזר, ובכך מאפשרים אוספים קלים יותר. יישום מוצלח של זרימת עבודה זו בוצע, והדגים את התועלת של שיטה הרמונית זו לקציר סלקטיבי של אוכלוסיות תאי גידול מה- TME לצורך ניתוח פרוטאומי כמותי, מרובב על ידי ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה. אסטרטגיה זו משתלבת באופן מלא עם סקירה היסטופתולוגית שגרתית, תוך מינוף ניתוח תמונות דיגיטליות כדי לתמוך בהעשרה של אוכלוסיות תאיות בעלות עניין והיא ניתנת להכללה מלאה, ומאפשרת קציר הרמוני של אוכלוסיות תאים מה-TME לצורך ניתוחים רב-אומיים.
ה-TME מייצג מערכת אקולוגית מורכבת המאוכלסת על ידי מערך מגוון מאוד של סוגי תאים, כגון תאי גידול, תאים סטרומליים, תאים סטרומליים, תאי מערכת החיסון, תאי אנדותל, סוגי תאים מזנכימליים אחרים ואדיפוציטים, יחד עם מטריצה חוץ-תאית מורכבת1. מערכת אקולוגית תאית זו משתנה בתוך אתרי איברי המחלה השונים ועל פניהם, וכתוצאה מכך ההטרוגניות המורכבת של הגידול 2,3. מחקרים אחרונים הראו כי גידולים הטרוגניים וגידולים עם תאי גידול נמוכים (טוהר נמוך) מתואמים לעתים קרובות עם פרוגנוזהשל מחלה לקויה 2,3.
כדי להבין את יחסי הגומלין המולקולריים בין אוכלוסיות של תאים סרטניים ולא סרטניים בתוך ה-TME בקנה מידה גדול, יש צורך באסטרטגיות סטנדרטיות ותפוקה גבוהה כדי לקצור באופן סלקטיבי אוכלוסיות תאיות שונות בעלות עניין לצורך ניתוח מולטיומי במורד הזרם. פרוטאומיקה כמותית מייצגת טכניקה מתפתחת במהירות וחשובה יותר ויותר לקידום ההבנה של הביולוגיה של הסרטן. עד כה, הנטייה המוקדמת של מחקרים שהשתמשו בפרוטאומיקה עשתה זאת עם חלבונים המופקים מהכנת רקמות גידול שלמות (למשל, בהקפאה), מה שהוביל לירידה בהבנת ההטרוגניות ברמת הפרוטאום ב-TME 4,5,6.
פיתוח אסטרטגיות איסוף דגימות המשתלבות בצורה חלקה עם זרימות עבודה של פתולוגיה קלינית ורותמות אותו, יאפשר דור חדש של פרוטאומיקה הנפתרת על-ידי היסטולוגיה, המשלימים מאוד את תהליכי העבודה של פתולוגיה אבחנתית בתקן זהב. LMD מאפשר איסוף ישיר וסלקטיבי של תת-אוכלוסיות תאיות או אזורי עניין (ROIs) באמצעות בדיקה מיקרוסקופית של מקטעים דקים של רקמות מוכתמות היסטולוגית7. ההתקדמות הגדולה האחרונה בפתולוגיה דיגיטלית ובניתוח מבוסס בינה מלאכותית הדגימו את היכולת לזהות תכונות הרכב ייחודיות ו- ROIs בתוך ה- TME באופן אוטומטי, שרבים מהם מתואמים עם שינויים מולקולריים ותכונות מחלה קליניות, כגון עמידות לטיפול ופרוגנוזה של מחלות8.
זרימת העבודה המתוארת בפרוטוקול המוצג כאן ממנפת פתרונות תוכנה מסחריים כדי לבאר באופן סלקטיבי ROIs של גידולים בתוך תמונות היסטופתולוגיה דיגיטליות, ומשתמשת בכלי תוכנה שפותחו בתוך החברה כדי להעביר את ה- ROIs של הגידולים הללו למיקרוסקופי לייזר לצורך איסוף אוטומטי של אוכלוסיות תאיות נפרדות בעלות עניין המשתלב בצורה חלקה עם זרימות עבודה של ניתוח רב-אומי במורד הזרם. אסטרטגיה משולבת זו מפחיתה באופן משמעותי את זמן מפעיל ה- LMD וממזערת את משך הזמן שעבורו רקמות נדרשות להיות בטמפרטורת הסביבה. השילוב של בחירת תכונות אוטומטית וקציר LMD עם פרוטאומיקה כמותית בתפוקה גבוהה מודגם באמצעות ניתוח דיפרנציאלי של ה-TME משני תת-סוגים היסטולוגיים מייצגים של סרטן השחלות האפיתליאלי, סרטן שחלות סרוס בדרגה גבוהה (HGSOC) וקרצינומה של תאים צלולים בשחלות (OCCC).
אמנם היו תקדימים מחקריים רבים שמטרתם לפתח ו/או לשפר זרימות עבודה להעשרת תת-אוכלוסיות של תאי מטרה מ-FFPE ו/או רקמות קפואות טריות ומתודולוגיות לשמירה על איכות הדגימה במהלך עיבוד 9,12,13,14,15, אך קיים צורך משמעותי בפיתוח אסטרטגיות אוטומטיות להכנת דגימות רקמות קליניות לניתוחים מולקולריים כדי להפחית את השונות ו להגדיל את יכולת השכפול. זרימת עבודה זו מתארת פרוטוקול מתוקנן וחצוי למחצה המשלב כלי תוכנה קיימים לניתוח תמונות (ראו טבלת החומרים) לצורך קצירה פתורה היסטולוגית של אוכלוסיות תאים בדידים על ידי LMD מדגימות רקמות קליניות.
העשרת LMD בפתרון מרחבי של ROIs הלוכדים אוכלוסיות תאים בדידים מייצגת שלב עיבוד רקמות מהדור הבא לפני ניתוחים מולטיומיים כדי לשפר את האפיון והזיהוי המולקולריים ולהקל על גילוי סמנים ביולוגיים סלקטיביים של תאים. פרוטוקול זה משפר את המתודולוגיות הקיימות על ידי הפחתת החשיפה הארוכה לעתים קרובות של מקטעי רקמות לסביבה הסביבתית הקשורה לסגמנטציה ידנית של ROI על ידי היסטולוג (שיכולה להימשך >1-2 שעות לפני איסוף ה- LMD). במקום זאת, זרימת עבודה זו מאפשרת ל-ROI להיות מזוהה מראש על-ידי סיווג ופילוח מונחי בינה מלאכותית. הגבלת זמן השהייה של רקמות תפחית את השונות המופרכת בהערכות של מטרות מולקולריות מבוישות מאוד, כגון פוספופפטידים ו-mRNA, או עבור טכניקות אנליטיות מבוססות נוגדנים המסתמכות על כך שחלבון מטרה נמצא בקונפורמציה הטבעית שלו לזיהוי.
חיתוך פידוקיאלים כיולים מסודרים על שקופית הממברנה PEN הנראים בבירור בתמונת השקופית הסרוקה הוא אחד המרכיבים המרכזיים המאפשרים שילוב של תוכנת ניתוח התמונות (ראה טבלת החומרים) עם זרימת העבודה של LMD. ההקפדה על כך שלכיולים תהיה נקודה מדויקת (“נקייה”) בתחתית צורת ה-“V” מאפשרת בחירה של נקודה מדויקת בתוכנת ניתוח התמונה שממנה יש לצייר את קווי הכיול, כמתואר בשלבים 5.1.6 ו-5.2.13. יישור של נקודות אלה במהלך הייבוא לתוכנת LMD הוא קריטי לכיסוי נכון של הביאורים (המתאפשרים באמצעות יצירת קובץ .xml תואם באמצעות האלגוריתמים “Malleator” ו/או “Dapọ”) לתוך החזר ההשקעה הרלוונטי של הרקמה בשקופית LMD הפיזית. יש צורך להדגיש את כל הצורות ובאופן קולקטיבי “לגרור ולשחרר” למקומם גם כאשר היישור מדויק עם הייבוא לתוכנת LMD כדי לרשום את המיקום האנכי (z-plane) של שלב השקופית במיקרוסקופ הלייזר. התאמות קלות למיקום הביאורים על פני החזר ההשקעה על הרקמה יכולות גם הן להתבצע במהלך שלב זה, במידת הצורך.
מגבלה של הגרסה הנוכחית של אלגוריתם Malleator היא שהיא אינה תואמת את כלי צורת הביאור המוגדרים מראש המסופקים על ידי תוכנת ניתוח התמונה (ראה טבלת החומרים), אם כי עדכונים /גרסאות עתידיות של האלגוריתם ישאפו לשפר תאימות זו. קובץ .annotation עבור צורות שצוירו באמצעות כלים אלה מכיל רק שתי קבוצות של קואורדינטות x ו- y מזווגות עבור כל ביאור, ללא הכיוון המרחבי המלא סביב נקודות אלה. השימוש הנוכחי בכלים אלה גורם לכך שהביאורים מומרים לקווים ישרים המוגדרים על-ידי שתי נקודות בלבד במהלך תהליך הייבוא. הגדרה ידנית של מקטעי ROI של רקמות נדרשת להמרה מוצלחת לתבנית XML וייבוא LMD. ניתן לבצע זאת על ידי הגדרה ידנית של כל ROI עם ביאורים מצולעים נפרדים ביד חופשית הספציפיים לאזור היעד או על ידי החלת ביאור עגול או מלבני משוער על פני כל מקטעי ההחזר על ההשקעה ברקמות, אם תרצה בכך, ויהיה תואם לזרימת עבודה זו.
בעוד שזרימת העבודה שהוצגה כאן הודגמה לצורך ניתוח פרוטאומי של דגימות רקמות סרטן אנושיות טריות קפואות, ניתן להשתמש באופן שווה ערך בזרימת עבודה זו של LMD המונעת על ידי בינה מלאכותית עם רקמות FFPE, סוגי רקמות שאינן סרטניות ואלה ממקורות שאינם אנושיים. הוא יכול גם לתמוך בתהליכי עבודה אחרים של יצירת פרופיל מולקולרי במורד הזרם, כולל ניתוחים תעתיקיים, גנומיים או פוספופרוטאומיים. זרימת עבודה זו יכולה גם למנף שימושים אחרים בתוכנת ניתוח התמונה (ראה טבלת החומרים), כולל עם יכולות הקשורות לספירת תאים או למודולים אנליטיים אחרים, כולל מודול “Multiplex IHC” או תוסף “רקמות מיקרו-מערך (TMA)”. יישומים עתידיים של זרימת עבודה זו עשויים גם להפיק תועלת מהגדרתם מראש של מספר התאים לכל מקטע ROI, ובכך להבטיח כניסות תאיות שוות ערך על פני אוספים מרובים, או על ידי שימוש בשיטות חלופיות להגדרת ROIs תאיים בעלי עניין, כגון על ידי אימונוהיסטוכימיה או סוציולוגיה של התא.
The authors have nothing to disclose.
המימון לפרויקט זה ניתן בחלקו על ידי תוכנית הבריאות הביטחונית (HU0001-16-2-0006 ו- HU0001-16-2-00014) לאוניברסיטת השירותים במדים למרכז המצוינות לסרטן גינקולוגי. לנותני החסות לא היה כל תפקיד בתכנון, בביצוע, בפרשנות או בכתיבה של המחקר. כתב ויתור: הדעות המובעות כאן הן של המחברים ואינן משקפות את המדיניות הרשמית של מחלקת הצבא/הצי/חיל האוויר, משרד ההגנה או ממשלת ארצות הברית.
1260 Infinity II System | Agilent Technologies Inc | Offline LC system | |
96 MicroCaps (150uL) in bulk | Pressure Biosciences Inc | MC150-96 | |
96 MicroPestles in bulk | Pressure Biosciences Inc | MP-96 | |
96 MicroTubes in bulk (no caps) | Pressure Biosciences Inc | MT-96 | |
9mm MS Certified Clear Screw Thread Kits | Fisher Scientific | 03-060-058 | Sample vial for offline LC frationation and mass spectrometry |
Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A995-4 | Mobile phase solvent |
Aperio AT2 | Leica Microsystems | 23AT2100 | Slide scanner |
Axygen PCR Tubes with 0.5 mL Flat Cap | Fisher Scientific | 14-222-292 | Sample tubes; size fits PCT tubes and thermocycler |
Barocycler 2320EXT | Pressure Biosciences Inc | 2320-EXT | Barocycler |
BCA Protein Assay Kit | Fisher Scientific | P123225 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
Easy-nLC 1200 | Thermo Fisher Scientific | Liquid Chromatography | |
EasyPep Maxi Sample Prep Kit | Thermo Fisher Scientific | NCI5734 | Post-label sample clean up column |
EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75 | Fisher Scientific | ES903 | Analytical column |
Eosin Y Solution Aqueous | Sigma Aldrich | HT110216 | |
Formic Acid, 99+ % | Thermo Fisher Scientific | 28905 | Mobile phase additive |
ggplot2 version 3.3.5 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/ | |
HALO | Indica Labs | Image analysis software | |
IDLE (Integrated Development and Learning Environment) | Python Software Foundation | ||
iheatmapr version 0.5.1 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/ | |
iRT Kit | Biognosys | Ki-3002-1 | LC-MS QAQC Standard |
limma version 3.42.2 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html | |
LMD Scanning stage Ultra LMT350 | Leica Microsystems | 11888453 | LMD stage model outfitted with PCT tube holder |
LMD7 (software version 8.2.3.7603) | Leica Microsystems | LMD apparatus (microscope, laser, camera, PC, tablet) | |
Mascot Server | Matrix Science | Data analysis software | |
Mass Spec-Compatible Human Protein Extract, Digest | Promega | V6951 | LC-MS QAQC Standard |
Mayer’s Hematoxylin Solution | Sigma Aldrich | MHS32 | |
PEN Membrane Glass Slides | Leica Microsystems | 11532918 | |
Peptide Retention Time Calibration Mixture | Thermo Fisher Scientific | 88321 | LC-MS QAQC Standard |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma Aldrich | P5726 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma Aldrich | P0044 | |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | Instrument calibration solution |
PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK | Fisher Scientific | 164535 | Pre-column |
Proteome Discoverer | Thermo Fisher Scientific | OPTON-31040 | Data analysis software |
Python | Python Software Foundation | ||
Q Exactive HF-X | Thermo Fisher Scientific | Mass spectrometer | |
R version 3.6.0 | CRAN | https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/ | |
RColorBrewer version 1.1-2 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/ | |
Soluble Smart Digest Kit | Thermo Fisher Scientific | 3251711 | Digestion reagent |
TMTpro 16plex Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | A44520 | isobaric TMT labeling reagents |
Veriti 60 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4384638 | Thermocycler |
Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | W6-4 | Mobile phase solvent |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 12.5 mm, 5 µm, guard cartridge (ZGC) | Agilent Technologies Inc | 821125-932 | Offline LC trap column |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 150 mm, 3.5 µm | Agilent Technologies Inc | 763750-902 | Offline LC analytical column |