Dit protocol beschrijft een high-throughput workflow voor kunstmatige intelligentie-gedreven segmentatie van pathologie-bevestigde gebieden van belang van gekleurde, dunne weefselsectiebeelden voor verrijking van histologie-opgeloste celpopulaties met behulp van lasermicrodissectie. Deze strategie omvat een nieuw algoritme dat de overdracht van afbakeningen die interessante celpopulaties aangeven, rechtstreeks naar lasermicroscopen mogelijk maakt.
De tumormicro-omgeving (TME) vertegenwoordigt een complex ecosysteem dat bestaat uit tientallen verschillende celtypen, waaronder tumor-, stroma- en immuuncelpopulaties. Om proteoomniveauvariatie en tumorheterogeniteit op schaal te karakteriseren, zijn high-throughput-methoden nodig om selectief discrete cellulaire populaties te isoleren in solide tumormaligniteiten. Dit protocol beschrijft een workflow met hoge doorvoer, mogelijk gemaakt door kunstmatige intelligentie (AI), die beelden van hematoxyline en eosine (H &E) -gekleurde, dunne weefselsecties segmenteert in pathologie-bevestigde regio’s die van belang zijn voor selectieve oogst van histologie-opgeloste celpopulaties met behulp van lasermicrodissectie (LMD). Deze strategie omvat een nieuw algoritme dat de overdracht mogelijk maakt van regio’s die celpopulaties van belang aangeven, geannoteerd met behulp van digitale beeldsoftware, rechtstreeks naar lasermicroscopen, waardoor meer gemakkelijke collecties mogelijk worden. Succesvolle implementatie van deze workflow werd uitgevoerd, wat het nut van deze geharmoniseerde methode aantoont om selectief tumorcelpopulaties uit de TME te oogsten voor kwantitatieve, multiplexed proteomische analyse door massaspectrometrie met hoge resolutie. Deze strategie integreert volledig met routinematige histopathologische beoordeling, waarbij gebruik wordt gemaakt van digitale beeldanalyse om verrijking van cellulaire populaties van belang te ondersteunen en is volledig generaliseerbaar, waardoor geharmoniseerde oogsten van celpopulaties van de TME mogelijk zijn voor multinomische analyses.
De TME vertegenwoordigt een complex ecosysteem bevolkt door een zeer diverse reeks celtypen, zoals tumorcellen, stromale cellen, immuuncellen, endotheelcellen, andere mesenchymale celtypen en adipocyten, samen met een complexe extracellulaire matrix1. Dit cellulaire ecosysteem varieert binnen en tussen verschillende ziekteorgaanlocaties, wat resulteert in complexe tumorheterogeniteit 2,3. Recente studies hebben aangetoond dat heterogene tumoren en tumoren met een lage tumorcellulaliteit (lage zuiverheid) vaak correleren met een slechte ziekteprognose 2,3.
Om het moleculaire samenspel tussen tumor- en niet-tumorcelpopulaties binnen de TME op schaal te begrijpen, zijn gestandaardiseerde en high-throughput strategieën nodig om selectief verschillende cellulaire populaties te oogsten die van belang zijn voor downstream multinomische analyse. Kwantitatieve proteomica vertegenwoordigt een snel evoluerende en steeds belangrijkere techniek om het begrip van kankerbiologie te bevorderen. Tot op heden heeft het overwicht van studies die proteomics gebruiken dit gedaan met eiwitten geëxtraheerd uit hele tumorweefselpreparaten (bijv. Gecryopeerd), wat leidt tot een tekort aan inzicht in het begrip van heterogeniteit op proteoomniveau in de TME 4,5,6.
De ontwikkeling van strategieën voor het verzamelen van monsters die naadloos integreren met en gebruikmaken van informatie uit klinische pathologieworkflows, zal een nieuwe generatie histologie-opgeloste proteomics mogelijk maken die zeer complementair zijn aan gouden standaard, diagnostische pathologieworkflows. LMD maakt directe en selectieve verzameling van cellulaire subpopulaties of regio’s van belang (ROIs) mogelijk door microscopische inspectie van histologisch gekleurd weefsel dunne secties7. Recente grote ontwikkelingen in digitale pathologie en AI-enabled analyse hebben aangetoond dat het mogelijk is om unieke compositorische kenmerken en ROI’s binnen de TME op een geautomatiseerde manier te identificeren, waarvan er vele correleren met moleculaire veranderingen en klinische ziektekenmerken, zoals resistentie tegen therapie en ziekteprognose8.
De workflow die wordt beschreven in het hier gepresenteerde protocol maakt gebruik van commerciële softwareoplossingen om selectief tumor-ROI’s te annoteren binnen digitale histopathologiebeelden en maakt gebruik van softwaretools die intern zijn ontwikkeld om deze tumor-ROI’s over te brengen naar lasermicroscopen voor geautomatiseerde verzameling van discrete cellulaire populaties van belang die naadloos integreert met downstream multinomische analyseworkflows. Deze geïntegreerde strategie vermindert de tijd van de LMD-operator aanzienlijk en minimaliseert de duur waarvoor weefsels bij omgevingstemperatuur moeten zijn. De integratie van geautomatiseerde functieselectie en LMD-oogst met high-throughput kwantitatieve proteomica wordt aangetoond door een differentiële analyse van de TME van twee representatieve epitheliale eierstokkanker histologische subtypen, hooggradige sereuze eierstokkanker (HGSOC) en ovarium clear cell carcinoom (OCCC).
Hoewel er meerdere onderzoeks precedenten zijn geweest gericht op het ontwikkelen en/of verbeteren van workflows voor verrijking van doelcellulaire subpopulaties uit FFPE en/of vers ingevroren weefsels en methodologieën voor het handhaven van de monsterkwaliteit tijdens de verwerking 9,12,13,14,15, bestaat er een aanzienlijke behoefte aan het ontwikkelen van geautomatiseerde strategieën voor het voorbereiden van klinische weefselmonsters voor moleculaire analyses om variabiliteit te verminderen en de reproduceerbaarheid te vergroten. Deze workflow beschrijft een gestandaardiseerd, semiautomatiseerd protocol dat bestaande softwaretools voor beeldanalyse integreert (zie de tabel met materialen) voor histologie-opgeloste oogst van discrete celpopulaties door LMD uit klinische weefselmonsters.
Ruimtelijk opgeloste LMD-verrijking van ROIs die discrete celpopulaties vastleggen, vertegenwoordigt een volgende generatie weefselverwerkingsstap voorafgaand aan multinomische analyses om moleculaire karakterisering en identificatie te verbeteren en celselectieve biomarkerontdekking te vergemakkelijken. Dit protocol verbetert bestaande methodologieën door de vaak lange blootstelling van weefselsecties aan de omgeving te verminderen die wordt geassocieerd met handmatige segmentatie van ROI door een histoloog (die >1-2 uur kan duren voorafgaand aan de LMD-verzameling). Deze workflow maakt het in plaats daarvan mogelijk om ROI vooraf te identificeren door AI-gestuurde classificatie en segmentatie. Het beperken van de verblijftijd van weefsel zal valse variaties verminderen in de beoordelingen van zeer labiele moleculaire doelen, zoals fosfopeptiden en mRNA, of voor op antilichamen gebaseerde analytische technieken die afhankelijk zijn van een doeleiwit in zijn oorspronkelijke conformatie voor detectie.
Het snijden van nette kalibratorfiducials op de PEN-membraandia die duidelijk zichtbaar zijn in de gescande diaafbeelding is een van de belangrijkste componenten die de integratie van de beeldanalysesoftware (zie de tabel met materialen) met de LMD-workflow mogelijk maken. Door ervoor te zorgen dat de kalibratoren een nauwkeurig (“schoon”) punt hebben aan de onderkant van de “V”-vorm, kan een nauwkeurig punt in de beeldanalysesoftware worden geselecteerd voor de kalibratorlijnen waaruit moet worden getrokken, zoals beschreven in stappen 5.1.6 en 5.2.13. Uitlijning van deze punten tijdens het importeren in de LMD-software is van cruciaal belang voor het correct overlappen van de annotaties (vergemakkelijkt door het genereren van een compatibel .xml bestand met behulp van de “Malleator” en / of “Dapọ” -algoritmen) op de relevante weefsel-ROI op de fysieke LMD-dia. Het is noodzakelijk om alle vormen te markeren en gezamenlijk “slepen en neerzetten” op zijn plaats, zelfs wanneer de uitlijning nauwkeurig is bij het importeren in de LMD-software om de verticale (z-plane) positie van de diatrap op de lasermicroscoop te registreren. Kleine aanpassingen aan de positionering van de annotaties over de weefsel-ROI kunnen ook tijdens deze stap worden gemaakt, indien nodig.
Een beperking van de huidige versie van het Malleator-algoritme is dat het niet compatibel is met de vooraf gedefinieerde annotatievormtools die door de beeldanalysesoftware worden geleverd (zie de tabel met materialen), hoewel toekomstige updates / versies van het algoritme erop gericht zullen zijn deze compatibiliteit te verbeteren. Het .annotatiebestand voor vormen die met deze gereedschappen zijn getekend, bevat slechts twee sets gekoppelde x- en y-coördinaten voor elke annotatie, zonder de volledige ruimtelijke oriëntatie rond die punten. Het huidige gebruik van deze hulpprogramma’s resulteert erin dat de annotaties worden geconverteerd naar rechte lijnen die tijdens het importproces door slechts twee punten worden gedefinieerd. Handmatige definitie van weefsel ROI-segmenten is vereist voor een succesvolle conversie naar XML-indeling en LMD-import. Dit kan worden uitgevoerd door elke ROI handmatig te definiëren met individuele polygonale annotaties uit de vrije hand die specifiek zijn voor het doelgebied of door een geschatte cirkelvormige of rechthoekige annotatie toe te passen op alle weefsel-ROI-segmenten, indien gewenst, en zal compatibel zijn met deze workflow.
Hoewel de hier gepresenteerde workflow werd gedemonstreerd voor proteomische analyse van vers ingevroren menselijke kankerweefselmonsters, kan deze AI-gestuurde LMD-workflow gelijkwaardig worden gebruikt met FFPE-weefsels, niet-kankerachtige weefseltypen en die van niet-menselijke bronnen. Het kan ook andere downstream moleculaire profileringsworkflows ondersteunen, waaronder transcriptomische, genomische of fosfoproteomische analyses. Deze workflow kan ook gebruikmaken van andere toepassingen van de beeldanalysesoftware (zie de tabel met materialen), inclusief mogelijkheden die verband houden met celtellingen of andere analytische modules, waaronder de module “Multiplex IHC” of de add-on “Tissue Microarray (TMA)”. Toekomstige toepassingen van deze workflow kunnen ook baat hebben bij het vooraf definiëren van het aantal cellen per ROI-segment, waardoor gelijkwaardige cellulaire inputs in meerdere collecties worden gegarandeerd, of door alternatieve methoden te gebruiken om cellulaire ROI’s van belang te definiëren, zoals door immunohistochemie of celsociologie.
The authors have nothing to disclose.
Financiering voor dit project werd gedeeltelijk verstrekt door het Defense Health Program (HU0001-16-2-0006 en HU0001-16-2-00014) aan de Uniformed Services University voor het Gynaecologisch Kankercentrum van uitmuntendheid. De sponsors hadden geen rol in het ontwerp, de uitvoering, de interpretatie of het schrijven van de studie. Disclaimer: De standpunten die hierin worden uitgedrukt, zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet het officiële beleid van het ministerie van leger / marine / luchtmacht, het ministerie van Defensie of de Amerikaanse regering.
1260 Infinity II System | Agilent Technologies Inc | Offline LC system | |
96 MicroCaps (150uL) in bulk | Pressure Biosciences Inc | MC150-96 | |
96 MicroPestles in bulk | Pressure Biosciences Inc | MP-96 | |
96 MicroTubes in bulk (no caps) | Pressure Biosciences Inc | MT-96 | |
9mm MS Certified Clear Screw Thread Kits | Fisher Scientific | 03-060-058 | Sample vial for offline LC frationation and mass spectrometry |
Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A995-4 | Mobile phase solvent |
Aperio AT2 | Leica Microsystems | 23AT2100 | Slide scanner |
Axygen PCR Tubes with 0.5 mL Flat Cap | Fisher Scientific | 14-222-292 | Sample tubes; size fits PCT tubes and thermocycler |
Barocycler 2320EXT | Pressure Biosciences Inc | 2320-EXT | Barocycler |
BCA Protein Assay Kit | Fisher Scientific | P123225 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
Easy-nLC 1200 | Thermo Fisher Scientific | Liquid Chromatography | |
EasyPep Maxi Sample Prep Kit | Thermo Fisher Scientific | NCI5734 | Post-label sample clean up column |
EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75 | Fisher Scientific | ES903 | Analytical column |
Eosin Y Solution Aqueous | Sigma Aldrich | HT110216 | |
Formic Acid, 99+ % | Thermo Fisher Scientific | 28905 | Mobile phase additive |
ggplot2 version 3.3.5 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/ | |
HALO | Indica Labs | Image analysis software | |
IDLE (Integrated Development and Learning Environment) | Python Software Foundation | ||
iheatmapr version 0.5.1 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/ | |
iRT Kit | Biognosys | Ki-3002-1 | LC-MS QAQC Standard |
limma version 3.42.2 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html | |
LMD Scanning stage Ultra LMT350 | Leica Microsystems | 11888453 | LMD stage model outfitted with PCT tube holder |
LMD7 (software version 8.2.3.7603) | Leica Microsystems | LMD apparatus (microscope, laser, camera, PC, tablet) | |
Mascot Server | Matrix Science | Data analysis software | |
Mass Spec-Compatible Human Protein Extract, Digest | Promega | V6951 | LC-MS QAQC Standard |
Mayer’s Hematoxylin Solution | Sigma Aldrich | MHS32 | |
PEN Membrane Glass Slides | Leica Microsystems | 11532918 | |
Peptide Retention Time Calibration Mixture | Thermo Fisher Scientific | 88321 | LC-MS QAQC Standard |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma Aldrich | P5726 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma Aldrich | P0044 | |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | Instrument calibration solution |
PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK | Fisher Scientific | 164535 | Pre-column |
Proteome Discoverer | Thermo Fisher Scientific | OPTON-31040 | Data analysis software |
Python | Python Software Foundation | ||
Q Exactive HF-X | Thermo Fisher Scientific | Mass spectrometer | |
R version 3.6.0 | CRAN | https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/ | |
RColorBrewer version 1.1-2 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/ | |
Soluble Smart Digest Kit | Thermo Fisher Scientific | 3251711 | Digestion reagent |
TMTpro 16plex Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | A44520 | isobaric TMT labeling reagents |
Veriti 60 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4384638 | Thermocycler |
Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | W6-4 | Mobile phase solvent |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 12.5 mm, 5 µm, guard cartridge (ZGC) | Agilent Technologies Inc | 821125-932 | Offline LC trap column |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 150 mm, 3.5 µm | Agilent Technologies Inc | 763750-902 | Offline LC analytical column |