약물 처리 후 종양 응집체 내의 국소 세포 밀도의 비파괴적 평가

Summary

본 프로토콜은 3D 종양 응집체 내에서 신속하고, 비파괴적이며, 라벨이 없는 지역 세포 밀도 및 생존력 측정을 위한 이미지 기반 기술을 개발한다. 연구 결과는 세포 밀도 구배를 밝혀 냈으며, 트라스투주맙으로 처리된 HER2+ 응집체에서 응집체를 개발하고 주로 말초 세포 사멸을 발달시키는 데 있어서 외층보다 코어 영역에서 더 높은 세포 밀도를 보였다.

Abstract

다세포 종양 스페로이드 (MCTSs) 모델은 암 진행 및 약물 발견 의 시험관내 연구에 대한 증가하는 유용성을 입증했다. 이러한 비교적 간단한 무혈관 구축물은 3D 구조 및 병리생리학적 구배와 같은 생체내 종양의 주요 측면을 모방한다. MCTSs 모델은 스페로이드 발달 중 및 약물에 대한 반응으로 암 세포 행동에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 그러나 필요한 크기는 비파괴 평가에 사용되는 도구를 크게 제한합니다. 광학 일관성 단층 촬영 구조 이미징 및 Imaris 3D 분석 소프트웨어는 MCTS 내의 지역 세포 밀도를 신속하고 비파괴적이며 라벨 없이 측정하기 위해 탐구됩니다. 이 접근법은 4 일간의 성숙 기간 동안 그리고 임상 적으로 관련된 항 HER2 약물 인 Trastuzumab을 사용한 연장 된 5 일 치료를 통해 MCTS를 평가하는 데 사용됩니다. 간략하게, AU565 HER2+ 유방암 MCTS는 마트리겔(기저막 매트릭스)의 첨가 유무에 관계없이 액체 오버레이를 통해 생성되어 다양한 형태학(각각 두껍고 디스크형 2.5D 응집체 또는 평평한 2D 응집체)의 응집체를 탐색했습니다. 외부 영역, 전이 영역 및 내부 코어 내의 세포 밀도는 성숙된 MCTS를 특징으로 하여, 외부 층에 비해 코어 영역에서 더 높은 세포 밀도를 갖는 세포 밀도 구배를 드러냈다. 매트릭스 추가는 셀 밀도를 재분배하고 이러한 구배를 향상시켜 외부 영역 밀도를 감소시키고 코어에서 셀 압축을 증가시켰다. 세포 밀도는 약물 반응의 잠재적인 지역적 차이를 평가하기 위해 점진적으로 더 깊은 100 μm 구역 내에서 약물 처리 (0 h, 24 h, 5일) 후에 정량화하였다. 최종 시점까지, 거의 모든 세포 사멸은 각 응집체의 외부 200 μm에 제약을 받는 것으로 나타났고, 응집체 내의 더 깊은 세포는 크게 영향을 받지 않는 것으로 나타났으며, 이는 약물 침투의 한계로 인한 약물 반응의 지역적 차이를 예시하였다. 현재의 프로토콜은 조밀 한 세포 조직 내의 지역 세포 밀도를 비파괴적으로 정량화하고 종으로 측정하는 독특한 기술을 제공합니다.

Introduction

연구자들은 종양 진행의 주요 특징 중 일부를 연구하기 위해 벤치 탑 3D 배양 시험관 내 시스템으로 크게 전환했습니다. 이 연구의 대부분은 다세포 종양 구상체 (MCTS)와 더 복잡한 오가노이드 ^1,2의 재 출현에 의해 주도되었습니다. 이러한 모델은 avascular이지만, 생체 내 ^3,4,5에서 발생하는 생리 학적 및 병리학 적 과정을 되풀이하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 특히, 중간 크기 모델 (직경 300-500 μm)은 코어 내 저산소증으로 인한 3D 구조, 병리 생리학적 구배 및 전이성 신호전달과 같은 주요 종양 특징을 모방 할 수 있습니다. 이 모델들은 혈관화된 생체 내 종양에서 볼 수 있는 특징적인 동심원층, 즉 증식성 세포의 외층, 노화/정지 세포의 과도기적 층, 그리고 코어에서 저산소증을 경험하는 세포를 나타낸다는 것은 잘 문서화되어 있다 3,6,7,8,9 . 독특한 통찰력은 이러한 층 내에서, 개발 중 및 약물에 대한 반응으로 세포 행동을 특성화함으로써 이러한 모델로부터 얻을 수 있습니다. 그러나 강력한 시험관 내 모델을 만드는 그라디언트를 개발하는 데 필요한 필수 MCTS 크기는 비파괴 평가에 사용되는 도구를 크게 제한합니다. 실제로 MTCS의 비파괴 분석에서 가장 큰 과제 중 하나는 세포 규모 세부 사항을 정량화하는 것입니다. 밝은 필드 및 위상차 현미경은 3D MCTS의 성장과 발달을 비파괴적으로 평가하기 위해 일상적으로 활용됩니다. 그러나 이러한 양식은 2D 프로젝션 으로 제한되며 이러한 모델^10,11,12,13의 중요한 3D 구조를 시각화 할 수있는 능력이 부족합니다. 세포독성 및 세포 증식에 대한 정보는 전형적으로 형광 이미징 (즉, 광-시트 현미경, 공초점 현미경) 또는 생체외 면역조직학적 염색^14,15,16을 통해 수집된다. 이러한 접근법은 조직 구조, 세포 밀도 및 세포 기능에 대한 귀중한 고해상도 정보를 제공하지만 종방향 분석을 방지하는 광학 클리어링, 고정 / 염색 또는 임베딩과 같은 샘플 준비가 필요한 경우가 많습니다.

OCT(Optical Coherence Tomography)는 위에서 언급한 도전 과제 중 일부를 극복할 수 있는 잠재력을 가진 비파괴 구조 이미징 양식입니다. 이 제품은 세포 분해능과 전체 다세포 응집체 ^17,18,19를 시각화 할 수있는 충분히 넓은 시야각 (최대 10mm x^10mm)을 자랑합니다. 중요하게도, 사용된 빛의 가시적 특성으로 인해, 이 기술은 완전히 비파괴적이고 라벨이 없다¹⁷. 또한 샘플을 시료 준비 없이도 현장에서 이미징할 수 있으므로 인큐베이터에서 샘플을 직접 채취하여 OCT(스캔 지속 시간 ~ 5-10분)로 신속하게 스캔한 다음 인큐베이터로 반환하여 종방향 특성화가 가능합니다. OCT를 사용하여 종양 스페로이드 행동을 분석하려는 많은 연구가 최근에 나타났습니다. 가장 흥미로운 시연 중 하나에서, Huang et al.은 OCT를 사용하여 대형 종양 스페로이드 모델 내에서 괴사 성 코어를 비파괴적으로 검출했으며, 살아있는 세포 영역과 죽은 세포 영역이 광학 감쇠의 눈에 띄는 차이를 가지고 있으며, 이는 라벨이없는 생존력 모니터링⁽²⁰)에 활용 될 수 있음을 지적했다. 유사하게, Hari 등은 샘플²¹ 내의 저산소증의 존재를 연구하기 위해 OCT로 영상화된 인간 결장암 (HCT116) 구상체의 굴절률 (RI) 측정을 수행하였다. 그들의 측정은 직접적인 추론에 충분하지 않았지만, 괴사 성 코어의 크기는 아니지만 부위와 상관 관계가있는 위치에서 더 낮은 RI를 관찰했으며 나중에 공초점 현미경을 통해 확인되었습니다. Abd El-Sadek et al.은 OCT를 사용하여 유방암 종양 모델²²의 지역 조직 생존력을 시각화하고 정량화했습니다. 그들은 조직 역학을 시각화하기위한 두 가지 OCT 기반 방법을보고했으며 이러한 메트릭의 차이와 살아있는 / 죽은 세포의 현미경 검사로 확인 된 영역 사이의 중간 상관 관계를 보여주었습니다.

OCT를 사용하여^10,23 개발 중에 MCTSs 유방암 모델 내에서 3D 형태 및 세포 수를 측정하기위한 정량적이고 비파괴적인 접근법을 수립하기 위해이 이전 문헌을 기반으로 한 우리의 출판 된 연구. Imaris 3D 렌더링 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 OCT 볼륨 스캔 내에서 이미지화된 세포 크기 개체(즉, 반점)의 수를 계수하기 위해, 세포 카운트는 응집 해리 시 혈구세포계를 통해 결정된 것과 통계적으로 유사한 MCTS에서 비파괴적으로 측정되었다. 그러나, OCT의 구조적 특성으로 인해, 괴사에 의한 세포 사멸 후에도 여전히 존재하는 세포막은 살아있는 세포로 잘못 계산될 수 있다. 더욱이, 이러한 특성화는 유망한 성공을 갖는 약물 처방을 실시한 개별 응집체 내의 세포 생존력을 비파괴적으로 추적하도록 확장되었다⁽¹⁰). 중요하게도, 유사한 세포 생존율이 우리의 OCT-Imaris 접근법으로부터 해리시 이들 샘플 내에서 벤치마킹된 것과 함께 보고되었다는 것이 주목되었다. 이 비파괴적이고 라벨이 없는 셀 접근법은 세포가 구성물/응집체 구조를 희생하지 않고 종방향으로 3D 구조물 및 조밀한 응집체 내에서 계수될 수 있게 한다.

본 연구는 OCT-Imaris가 3D 응집체 형태학과 세포 수를 측정하는 능력을 활용하여 조밀 응집체 내의 지역 세포 밀도를 직접 정량화하는 개선 된 접근법을보고합니다. 이러한 방법론적 발전은 MCTS 모델의 특징적인 동심원 층 내에서 세포의 공간적 분포와 증식에 대한 보다 상세한 그림을 제공한다. 단순히 전체 평균 응집체 세포 밀도를 계산하는 대신, 이러한 국소 밀도 측정은 다짐과 관련된 것과 같은 세포 밀도 구배를 나타낼 수 있다. 이 지역 평가는 또한 국소 세포 밀도의 변화에 의해 측정되는 국소 약물 반응을 평가하기 위해 화학요법으로 처리된 응집체에도 적용된다. OCT와 고급 이미징 분석 방법의 이러한 조합은 지역 세포 생존력의 정량화를 제공하며, 이는 세포 밀도의 감소를 경험하는 영역을 기반으로 약물 침투를 탐구하는 데 사용될 수 있습니다. 이것은 조밀 한 세포 조직 내의 약물에 반응하여 지역 세포 밀도와 생존력을 비파괴적으로 정량화하고 종으로 측정하는 첫 번째 보고서입니다. 전체 MCTS에 걸친 입체 세포 밀도 및 공간 분포의 이러한 특성화는 암 치료에서 약물 전달을 최적화하고 암 모델 진행에 대한 이해를 향상시키는 데 도움이 될 수 있습니다.

Protocol

AU565 (HER2+) 및 MDA-MB-231 유방암 세포주를 본 연구에 사용하였다 ( 물질의 표 참조). 1. 종양 응집체 준비 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI) 1640 기본 배지(+)를 사용하여 10%(v/v) 태아 소 혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 L-글루타민을 사용하여 AU565(HER2+) 유방암 세포 성장 배지를 준비 합니다(자료 표 참조). 10% (v/…

Representative Results

이전 간행물에서, OCT10을 사용하여 세포 응집체 내의 글로벌 세포 밀도의 비파괴적 측정을 위한 방법이 확립되었다. 본원에서, 이러한 기술은 발달하는 세포 응집체의 국소 세포 밀도를 평가하기 위해 확장된다. 도 1은 이러한 확장의 개략도를 보여주며, 여기서 셀 밀도는 도 1B,C의 노란색 원으로 표시된 작은 (직경 100 μm) …

Discussion

중요성
다세포 종양 구상체 (MCTS)는 종양 진행 및 약물 스크리닝 ^1,2,3을 연구하기위한 강력한 ^3D 시험관 내 모델입니다. 이러한 비교적 간단한 응집체 모델의 유용성을 향상시키는 것은 종양 모델 진행 및 치료 반응 모두에 영향을 미치는 것으로 알려진 형태학 및 세포 밀도와 같은 주요 특징의 특성화에 크…

Materials

96 well plates	Greiner Bio-One	650970	CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/
0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
AU565 breast cancer cells	ATCC
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020
FIJI software	open-source	(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j	Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267151B
Imaris image analysis software	Bitplane		Current version 9.8
L-glutamine	Lonza	17-605E
Matrigel	Corning	354263
MDA-MB-231 breast cancer cells	ATCC
Microscope	Zeiss	Z1 AxioVision
Penicilin streptomycin	Corning	30-0002CI
Plate centrifuge	Eppendorf
RPMI medium 1640	Gibco	11875-085
Spectral Domain Optical Coherence Tomography	ThorLabs	TEL220C1
T75 cell culture flasks	Greiner Bio-One	658175
Trastuzumab			Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy.