Zerstörungsfreie Bewertung der regionalen Zelldichte innerhalb von Tumoraggregaten nach medikamentöser Behandlung

Summary

Das vorliegende Protokoll entwickelt eine bildbasierte Technik zur schnellen, zerstörungsfreien und markierungsfreien Messung der regionalen Zelldichte und -lebensfähigkeit innerhalb von 3D-Tumoraggregaten. Die Ergebnisse zeigten einen Zelldichtegradienten mit höheren Zelldichten in Kernregionen als in äußeren Schichten in sich entwickelnden Aggregaten und überwiegend peripherem Zelltod in HER2+-Aggregaten, die mit Trastuzumab behandelt wurden.

Abstract

Multizelluläre Tumorsphäroid-Modelle (MCTSs) haben einen zunehmenden Nutzen für In-vitro-Studien zur Krebsprogression und Arzneimittelentdeckung gezeigt. Diese relativ einfachen avaskulären Konstrukte ahmen Schlüsselaspekte von In-vivo-Tumoren nach, wie 3D-Struktur und pathophysiologische Gradienten. MCTS-Modelle können Einblicke in das Verhalten von Krebszellen während der Sphäroidentwicklung und als Reaktion auf Medikamente liefern; Ihre erforderliche Größe schränkt jedoch die für die zerstörungsfreie Bewertung verwendeten Werkzeuge drastisch ein. Optische Kohärenztomographie Strukturbildgebung und Imaris 3D-Analysesoftware werden für die schnelle, zerstörungsfreie und markierungsfreie Messung der regionalen Zelldichte innerhalb von MCTS erforscht. Dieser Ansatz wird verwendet, um MCTS über eine 4-tägige Reifezeit und während einer ausgedehnten 5-tägigen Behandlung mit Trastuzumab, einem klinisch relevanten Anti-HER2-Medikament, zu bewerten. Kurz gesagt, AU565 HER2+ Brustkrebs-MCTSs wurden mittels flüssiger Überlagerung mit oder ohne Zugabe von Matrigel (einer Basalmembranmatrix) hergestellt, um Aggregate verschiedener Morphologien (dickere, scheibenartige 2,5D-Aggregate bzw. flache 2D-Aggregate) zu untersuchen. Die Zelldichte innerhalb der äußeren Region, der Übergangsregion und des inneren Kerns wurde in gereiften MCTSs charakterisiert, was einen Zelldichtegradienten mit höheren Zelldichten in den Kernregionen im Vergleich zu den äußeren Schichten zeigte. Die Matrixaddition verteilte die Zelldichte neu und verstärkte diesen Gradienten, verringerte die Dichte der äußeren Zone und erhöhte die Zellverdichtung in den Kernen. Die Zelldichte wurde nach medikamentöser Behandlung (0 h, 24 h, 5 Tage) in zunehmend tieferen 100-μm-Zonen quantifiziert, um mögliche regionale Unterschiede in der Arzneimittelreaktion zu bewerten. Zum letzten Zeitpunkt schien fast der gesamte Zelltod auf die äußeren 200 μm jedes Aggregats beschränkt zu sein, während Zellen tiefer im Aggregat weitgehend unberührt zu sein schienen, was regionale Unterschiede in der Arzneimittelreaktion veranschaulicht, möglicherweise aufgrund von Einschränkungen der Arzneimittelpenetration. Das aktuelle Protokoll bietet eine einzigartige Technik, um die regionale Zelldichte in dichtem Zellgewebe zerstörungsfrei zu quantifizieren und in Längsrichtung zu messen.

Introduction

Forscher haben sich weitgehend auf 3D-Tischkultur-In-vitro-Systeme konzentriert, um einige der wichtigsten Merkmale der Tumorprogression zu untersuchen. Ein Großteil dieser Forschung wurde durch das Wiederauftreten von multizellulären Tumorsphäroiden (MCTSs) und komplexeren Organoiden^{geleitet 1,2}. Obwohl diese Modelle avaskulär sind, bieten sie ein leistungsfähiges Werkzeug zur Rekapitulation physiologischer und pathologischer Prozesse, die in vivo ^3,4,5 auftreten. Insbesondere mittelgroße Modelle (300-500 μm Durchmesser) können wichtige Tumormerkmale wie 3D-Struktur, pathophysiologische Gradienten und metastatische Signalgebung aufgrund von Hypoxie im Kern nachahmen. Es ist gut dokumentiert, dass diese Modelle die charakteristischen konzentrischen Schichten aufweisen, die in vaskularisierten In-vivo-Tumoren zu sehen sind, nämlich eine äußere Schicht proliferativer Zellen, eine Übergangsschicht von seneszenten/ruhenden Zellen und Zellen, die im Kern an Hypoxie leiden 3,6,7,8,9 . Aus diesen Modellen können einzigartige Erkenntnisse gewonnen werden, indem das Zellverhalten innerhalb dieser Schichten, während der Entwicklung und als Reaktion auf das Medikament charakterisiert wird. Die erforderliche MCTS-Größe, die notwendig ist, um die Gradienten zu entwickeln, die sie zu so leistungsfähigen In-vitro-Modellen machen, schränkt jedoch die für die zerstörungsfreie Bewertung verwendeten Werkzeuge drastisch ein. Tatsächlich ist eine der größten Herausforderungen bei der zerstörungsfreien Analyse von MTCS die Quantifizierung von Details im Zellmaßstab. Die Hellfeld- und Phasenkontrastmikroskopie wird routinemäßig eingesetzt, um das Wachstum und die Entwicklung von 3D-MCTS zerstörungsfrei zu bewerten. Diese Modalitäten sind jedoch auf 2D-Projektionen beschränkt, da sie nicht in der Lage sind, die entscheidende 3D-Struktur dieser Modelle^10,11,12,13 zu visualisieren. Informationen über Zytotoxizität und Zellproliferation werden typischerweise durch fluoreszierende Bildgebung (d. h. Lichtblattmikroskopie, konfokale Mikroskopie) oder ex vivo immunhistologische Färbung^14,15,16 gesammelt. Während diese Ansätze wertvolle, hochauflösende Informationen über Gewebestruktur, Zelldichte und Zellfunktion liefern, erfordern sie häufig eine Probenvorbereitung wie optisches Clearing, Fixierung / Färbung oder Einbettung, die Längsschnittanalysen verhindert.

Die optische Kohärenztomographie (OCT) ist eine zerstörungsfreie strukturelle Bildgebungsmodalität, die das Potenzial hat, einige der oben genannten Herausforderungen zu überwinden. Es verfügt über eine zelluläre Auflösung und ein ausreichend breites Sichtfeld (bis zu 10 mm x 10 mm), das in der Lage ist, ganze mehrzellige Aggregate zu visualisieren^17,18,19. Wichtig ist, dass diese Technik aufgrund der sichtbaren Natur des verwendeten Lichts völlig zerstörungsfrei und markierungsfrei^{ist 17}. Außerdem können Proben in situ abgebildet werden, ohne dass eine Probenvorbereitung erforderlich ist, so dass die Proben direkt aus dem Inkubator entnommen, schnell mit OCT gescannt (Scandauer ~ 5-10 min) und dann in den Inkubator zurückgeführt werden können, was eine Längscharakterisierung ermöglicht. Viele Studien, die OCT zur Analyse des Tumorsphäroidverhaltens einsetzen wollen, sind kürzlich aufgetaucht. In einer der aufregendsten Demonstrationen verwendeten Huang et al. OCT, um nekrotische Kerne in großen Tumorsphäroidmodellen zerstörungsfrei zu erkennen, und stellten fest, dass lebende und tote Zellregionen erkennbare Unterschiede in der optischen Dämpfung aufweisen, die für die markierungsfreie Lebensfähigkeitsüberwachung verwendet werden können²⁰. In ähnlicher Weise führten Hari et al. Messungen des Brechungsindex (RI) von humanem Darmkrebs (HCT116) -Sphäroiden durch, die mit OCT aufgenommen wurden, um das Vorhandensein von Hypoxie in den Proben^{zu untersuchen 21}. Ihre Messungen reichten nicht für direkte Schlussfolgerungen aus, obwohl sie niedrigere RI an Orten beobachteten, die mit der Stelle, wenn auch nicht mit der Größe, nekrotischer Kerne korrelierten, die später durch konfokale Mikroskopie identifiziert wurden. Abd El-Sadek et al. verwendeten OCT, um die regionale Gewebelebensfähigkeit von Brustkrebstumormodellen zu visualisieren und zu quantifizieren²². Sie berichteten über zwei OCT-basierte Methoden zur Visualisierung der Gewebedynamik und zeigten eine moderate Korrelation zwischen Unterschieden in diesen Metriken und mikroskopisch identifizierten Regionen lebender / toter Zellen.

Unsere veröffentlichte Arbeit unter Verwendung von OCT baute auf dieser früheren Literatur auf, um einen quantitativen, zerstörungsfreien Ansatz zur Messung der 3D-Morphologie und Zellzahl in MCTSs Brustkrebsmodellen während der Entwicklung^{zu etablieren 10,23}. Mit der Imaris 3D-Rendering-Bildanalysesoftware zur Zählung der Anzahl der zellgroßen Objekte (d. h. Flecken), die in den OCT-Volumenscans abgebildet wurden, wurden die Zellzahlen zerstörungsfrei in MCTSs gemessen, die statistisch denen ähnlich waren, die über Hämozytometer bei aggregierter Dissoziation bestimmt wurden. Aufgrund der strukturellen Natur der OCT können Zellmembranen, die nach dem Zelltod durch Nekrose noch vorhanden sind, fälschlicherweise als lebende Zellen gezählt werden. Darüber hinaus wurde diese Charakterisierung auf die zerstörungsfreie Verfolgung der Zelllebensfähigkeit innerhalb einzelner Aggregate ausgeweitet, die einem Wirkstoffregime mit vielversprechendem Erfolg unterzogen wurden¹⁰. Wichtig ist, dass festgestellt wurde, dass eine ähnliche Zelllebensfähigkeit von unserem OCT-Imaris-Ansatz berichtet wurde, mit dem, was in diesen Proben bei Dissoziation verglichen wurde. Dieser zerstörungsfreie und markierungsfreie Zellansatz ermöglicht es, Zellen innerhalb von 3D-Konstrukten und dichte Aggregate längs zu zählen, ohne die Konstrukt- / Aggregatstruktur zu beeinträchtigen.

Die vorliegende Arbeit berichtet über einen verbesserten Ansatz zur direkten Quantifizierung der regionalen Zelldichte innerhalb dichter Aggregate, indem die Fähigkeit von OCT-Imaris genutzt wird, sowohl die Morphologie als auch die Zellzahl von 3D-Aggregaten zu messen. Diese methodische Weiterentwicklung liefert ein detaillierteres Bild der räumlichen Verteilung und Proliferation von Zellen innerhalb der charakteristischen konzentrischen Schichten von MCTS-Modellen. Anstatt einfach eine durchschnittliche Gesamtzelldichte zu berechnen, können solche lokalen Dichtemessungen Zelldichtegradienten aufdecken, z. B. solche, die mit der Verdichtung verbunden sind. Diese regionale Bewertung wird auch auf Aggregate angewendet, die mit einem Chemotherapeutikum behandelt werden, um die regionale Arzneimittelreaktion zu bewerten, gemessen an Veränderungen der lokalen Zelldichte. Diese Kombination aus OCT und fortschrittlichen bildgebenden Analysemethoden bietet eine Quantifizierung der regionalen Zelllebensfähigkeit, die verwendet werden kann, um die Arzneimittelpenetration basierend darauf zu untersuchen, in welchen Regionen die Zelldichte abnimmt. Dies ist der erste Bericht, der die regionale Zelldichte und Lebensfähigkeit als Reaktion auf das Medikament in dichtem Zellgewebe zerstörungsfrei quantifiziert und in Längsrichtung misst. Eine solche Charakterisierung der dreidimensionalen Zelldichte und der räumlichen Verteilung über ganze MCTS kann dazu beitragen, die Arzneimittelabgabe bei der Krebsbehandlung zu optimieren und das Verständnis der Progression von Krebsmodellen zu verbessern.

Protocol

Für die vorliegende Studie wurden AU565 (HER2+) und MDA-MB-231 Brustkrebszelllinien verwendet (siehe Materialtabelle). 1. Vorbereitung von Tumoraggregaten Bereiten Sie AU565 (HER2+) Brustkrebszellwachstumsmedien mit dem Basalmedium (+) des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 in L-Glutamin vor, ergänzt mit 10% (v/v) fetalem Rinderserum und 1% Penicillin/Streptomycin (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie MDA-MB-231 …

Representative Results

In einer früheren Veröffentlichung wurde eine Methode zur zerstörungsfreien Messung der globalen Zelldichte innerhalb zellulärer Aggregate unter Verwendung vonOCT 10 etabliert. Hierin wird diese Technik erweitert, um die regionale Zelldichte von sich entwickelnden Zellaggregaten zu beurteilen. Abbildung 1 zeigt ein Schema dieser Ausdehnung, bei dem die Zelldichte in konzentrischen Schichten eines Sphäroids oder lokaler bewertet werden kann, indem stattdessen klei…

Discussion

Bedeutung
Multizelluläre Tumorsphäroide (MCTSs) sind leistungsstarke 3D-In-vitro-Modelle zur Untersuchung der Tumorprogression und des Arzneimittelscreenings ^1,2,3. Die Förderung des Nutzens dieser relativ einfachen Aggregatmodelle hängt stark von der Charakterisierung ihrer Hauptmerkmale wie Morphologie und Zelldichte ab, von denen bekannt ist, dass sie sowohl die Progression des Tumormodells al…

Materials

96 well plates	Greiner Bio-One	650970	CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/
0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
AU565 breast cancer cells	ATCC
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020
FIJI software	open-source	(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j	Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267151B
Imaris image analysis software	Bitplane		Current version 9.8
L-glutamine	Lonza	17-605E
Matrigel	Corning	354263
MDA-MB-231 breast cancer cells	ATCC
Microscope	Zeiss	Z1 AxioVision
Penicilin streptomycin	Corning	30-0002CI
Plate centrifuge	Eppendorf
RPMI medium 1640	Gibco	11875-085
Spectral Domain Optical Coherence Tomography	ThorLabs	TEL220C1
T75 cell culture flasks	Greiner Bio-One	658175
Trastuzumab			Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy.