Évaluation non destructive de la densité cellulaire régionale dans les agrégats tumoraux après un traitement médicamenteux

Summary

Le présent protocole développe une technique basée sur l’image pour la mesure rapide, non destructive et sans étiquette de la densité cellulaire régionale et de la viabilité dans les agrégats tumoraux 3D. Les résultats ont révélé un gradient de densité cellulaire, avec des densités cellulaires plus élevées dans les régions centrales que dans les couches externes dans les agrégats en développement et principalement la mort cellulaire périphérique dans les agrégats HER2+ traités avec trastuzumab.

Abstract

Les modèles de sphéroïdes tumoraux multicellulaires (SCTM) ont démontré une utilité croissante pour l’étude in vitro de la progression du cancer et la découverte de médicaments. Ces constructions avasculaires relativement simples imitent des aspects clés des tumeurs in vivo , tels que la structure 3D et les gradients physiopathologiques. Les modèles MCTS peuvent fournir des informations sur le comportement des cellules cancéreuses pendant le développement des sphéroïdes et en réponse aux médicaments; cependant, leur taille requise limite considérablement les outils utilisés pour l’évaluation non destructive. L’imagerie structurelle par tomographie par cohérence optique et le logiciel d’analyse 3D Imaris sont explorés pour une mesure rapide, non destructive et sans étiquette de la densité cellulaire régionale dans les SCTM. Cette approche est utilisée pour évaluer les SCT sur une période de maturation de 4 jours et tout au long d’un traitement prolongé de 5 jours avec le Trastuzumab, un médicament anti-HER2 cliniquement pertinent. En bref, les MCTS au565 HER2+ pour le cancer du sein ont été créés par superposition liquide avec ou sans ajout de Matrigel (une matrice de membrane basale) pour explorer des agrégats de différentes morphologies (agrégats 2.5D plus épais, semblables à des disques ou agrégats 2D plats, respectivement). La densité cellulaire dans la région externe, la région de transition et le noyau interne a été caractérisée dans les SCTM matures, révélant un gradient de densité cellulaire avec des densités cellulaires plus élevées dans les régions centrales par rapport aux couches externes. L’addition de matrice a redistribué la densité cellulaire et amélioré ce gradient, diminuant la densité de la zone externe et augmentant le compactage cellulaire dans les noyaux. La densité cellulaire a été quantifiée après un traitement médicamenteux (0 h, 24 h, 5 jours) dans des zones progressivement plus profondes de 100 μm afin d’évaluer les différences régionales potentielles dans la réponse aux médicaments. Au dernier point temporel, presque toute la mort cellulaire semblait être limitée aux 200 μm externes de chaque agrégat, tandis que les cellules plus profondes dans l’agrégat semblaient en grande partie intactes, illustrant les différences régionales dans la réponse au médicament, peut-être en raison des limitations de la pénétration du médicament. Le protocole actuel fournit une technique unique pour quantifier de manière non destructive la densité cellulaire régionale dans les tissus cellulaires denses et la mesurer longitudinalement.

Introduction

Les chercheurs se sont largement tournés vers les systèmes de culture 3D in vitro de paillasse pour étudier certaines des caractéristiques clés de la progression tumorale. Une grande partie de ces recherches a été menée par la réémergence de sphéroïdes tumoraux multicellulaires (SCTM) et d’organoïdes plus complexes ^1,2. Bien que ces modèles soient avasculaires, ils fournissent un outil puissant pour récapituler les processus physiologiques et pathologiques qui se produisent in vivo ^3,4,5. En particulier, les modèles de taille moyenne (300-500 μm de diamètre) peuvent imiter les caractéristiques clés de la tumeur telles que la structure 3D, les gradients physiopathologiques et la signalisation métastatique due à l’hypoxie dans le noyau. Il est bien documenté que ces modèles présentent les couches concentriques caractéristiques observées dans les tumeurs in vivo vascularisées, à savoir une couche externe de cellules prolifératives, une couche transitionnelle de cellules sénescentes / quiescentes et des cellules souffrant d’hypoxie dans le noyau ^3,6,7,8,9 . Des informations uniques peuvent être obtenues à partir de ces modèles en caractérisant le comportement cellulaire au sein de ces couches, pendant le développement et en réponse au médicament. Cependant, la taille requise des SCTM, nécessaire pour développer les gradients qui en font des modèles in vitro aussi puissants, limite considérablement les outils utilisés pour l’évaluation non destructive. En effet, l’un des plus grands défis de l’analyse non destructive des MTCS est la quantification des détails à l’échelle cellulaire. La microscopie à champ lumineux et à contraste de phase est couramment utilisée pour évaluer la croissance et le développement des SCTM 3D de manière non destructive. Cependant, ces modalités sont limitées aux projections 2D, manquant de la capacité de visualiser la structure 3D cruciale de ces modèles 10,11,12,13. L’information sur la cytotoxicité et la prolifération cellulaire est généralement recueillie par imagerie fluorescente (c.-à-d. microscopie à feuille de lumière, microscopie confocale) ou par coloration immunohistologique ex vivo 14,15,16. Bien que ces approches fournissent des informations précieuses et à haute résolution sur la structure tissulaire, la densité cellulaire et la fonction cellulaire, elles nécessitent souvent la préparation d’échantillons tels que le nettoyage optique, la fixation / coloration ou l’intégration qui empêche les analyses longitudinales.

La tomographie par cohérence optique (OCT) est une modalité d’imagerie structurelle non destructive qui a le potentiel de surmonter certains des défis mentionnés ci-dessus. Il bénéficie d’une résolution cellulaire et d’un champ de vision suffisamment large (jusqu’à 10 mm x 10 mm) capable de visualiser des agrégats multicellulaires entiers 17,18,19. Il est important de noter qu’en raison de la nature visible de la lumière utilisée, cette technique est totalement non destructive et sans étiquette¹⁷. En outre, les échantillons peuvent être imagés in situ sans nécessiter de préparation d’échantillons, de sorte que les échantillons peuvent être prélevés directement de l’incubateur, rapidement scannés avec OCT (durée de numérisation ~ 5-10 min), puis retournés à l’incubateur, permettant une caractérisation longitudinale. De nombreuses études cherchant à utiliser l’OCT pour analyser le comportement des sphéroïdes tumoraux ont récemment émergé. Dans l’une des démonstrations les plus passionnantes, Huang et al. ont utilisé l’OCT pour détecter de manière non destructive les noyaux nécrotiques dans de grands modèles de sphéroïdes tumoraux, notant que les régions de cellules vivantes et mortes possèdent des différences perceptibles dans l’atténuation optique, qui peuvent être utilisées pour la surveillance de la viabilité sans étiquette²⁰. De même, Hari et al. ont effectué des mesures de l’indice de réfraction (IR) des sphéroïdes du cancer du côlon humain (HCT116) imagés avec OCT pour étudier la présence d’hypoxie dans les échantillons²¹. Leurs mesures n’étaient pas suffisantes pour les inférences directes, bien qu’ils aient observé une IR plus faible dans des endroits qui étaient en corrélation avec le site, mais pas la taille, des carottes nécrotiques, identifiées plus tard par microscopie confocale. Abd El-Sadek et al. ont utilisé l’OCT pour visualiser et quantifier la viabilité tissulaire régionale des modèles tumoraux du cancer du sein²². Ils ont rapporté deux méthodes basées sur l’OCT pour visualiser la dynamique tissulaire et ont montré une corrélation modérée entre les différences dans ces mesures et les régions identifiées par microscopie de cellules vivantes / mortes.

Nos travaux publiés utilisant l’OCT se sont appuyés sur cette littérature antérieure pour établir une approche quantitative et non destructive pour mesurer la morphologie 3D et le nombre de cellules dans les modèles de cancer du sein MCTS au cours du développement^10,23. En utilisant le logiciel d’analyse d’images de rendu 3D Imaris pour compter le nombre d’objets de la taille d’une cellule (c’est-à-dire des taches) imagés dans les scans de volume OCT, le nombre de cellules a été mesuré de manière non destructive dans des SCTM qui étaient statistiquement similaires à ceux déterminés par hémocytomètre lors de la dissociation agrégée. Cependant, en raison de la nature structurelle de l’OCT, les membranes cellulaires encore présentes après la mort cellulaire par nécrose peuvent être comptées à tort comme des cellules vivantes. De plus, cette caractérisation a été étendue pour suivre de manière non destructive la viabilité cellulaire au sein d’agrégats individuels soumis à un régime médicamenteux avec un succès prometteur¹⁰. Fait important, il a été noté que notre approche OCT-Imaris a rapporté une viabilité cellulaire similaire avec ce qui a été comparé dans ces échantillons lors de la dissociation. Cette approche cellulaire non destructive et sans étiquette permet de compter les cellules dans des constructions 3D et des agrégats denses longitudinalement sans sacrifier la structure construction/agrégat.

Le présent travail fait état d’une approche améliorée pour quantifier directement la densité cellulaire régionale dans les agrégats denses en tirant parti de la capacité d’OCT-Imaris à mesurer à la fois la morphologie des agrégats 3D et le nombre de cellules. Cette avancée méthodologique fournit une image plus détaillée de la distribution spatiale et de la prolifération des cellules dans les couches concentriques caractéristiques des modèles MCTS. Plutôt que de simplement calculer une densité cellulaire agrégée moyenne globale, de telles mesures de densité locale peuvent révéler des gradients de densité cellulaire, tels que ceux associés au compactage. Cette évaluation régionale est également appliquée aux agrégats traités avec un agent chimiothérapeutique afin d’évaluer la réponse régionale aux médicaments, mesurée par les changements dans la densité cellulaire locale. Cette combinaison d’OCT et de méthodes d’analyse d’imagerie avancées fournit une quantification de la viabilité cellulaire régionale, qui peut être utilisée pour explorer la pénétration des médicaments en fonction des régions qui connaissent une diminution de la densité cellulaire. Il s’agit du premier rapport à quantifier de manière non destructive la densité cellulaire régionale et la viabilité en réponse au médicament dans les tissus cellulaires denses et à le mesurer longitudinalement. Une telle caractérisation de la densité cellulaire tridimensionnelle et de la distribution spatiale dans des SCTM entiers peut aider à optimiser l’administration de médicaments dans le traitement du cancer et à améliorer la compréhension de la progression du modèle du cancer.

Protocol

Les lignées cellulaires de cancer du sein AU565 (HER2+) et MDA-MB-231 ont été utilisées pour la présente étude (voir tableau des matériaux). 1. Préparation des agrégats tumoraux Préparer le milieu de croissance des cellules cancéreuses du sein AU565 (HER2+) à l’aide du milieu basal (+) 1640 du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) dans la L-glutamine complétée par 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin et 1 % de pénicilline/streptomycine…

Representative Results

Dans une publication antérieure, une méthode a été établie pour la mesure non destructive de la densité cellulaire globale dans les agrégats cellulaires à l’aide de l’OCT10. Ici, cette technique est étendue pour évaluer la densité cellulaire régionale des agrégats cellulaires en développement. La figure 1 montre un schéma de cette extension, où la densité cellulaire peut être évaluée en couches concentriques d’un sphéroïde ou plus localemen…

Discussion

Importance
Les sphéroïdes tumoraux multicellulaires (SCTM) sont de puissants modèles in vitro 3D pour l’étude de la progression tumorale et le dépistage des médicaments ^1,2,3. L’avancement de l’utilité de ces modèles agrégés relativement simples repose fortement sur la caractérisation de leurs caractéristiques clés, telles que la morphologie et la densité cellulaire, qui sont conn…

Materials

96 well plates	Greiner Bio-One	650970	CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/
0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
AU565 breast cancer cells	ATCC
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020
FIJI software	open-source	(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j	Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267151B
Imaris image analysis software	Bitplane		Current version 9.8
L-glutamine	Lonza	17-605E
Matrigel	Corning	354263
MDA-MB-231 breast cancer cells	ATCC
Microscope	Zeiss	Z1 AxioVision
Penicilin streptomycin	Corning	30-0002CI
Plate centrifuge	Eppendorf
RPMI medium 1640	Gibco	11875-085
Spectral Domain Optical Coherence Tomography	ThorLabs	TEL220C1
T75 cell culture flasks	Greiner Bio-One	658175
Trastuzumab			Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy.