Niet-destructieve evaluatie van regionale celdichtheid binnen tumoraggregaten na medicamenteuze behandeling
Summary
Het huidige protocol ontwikkelt een beeldgebaseerde techniek voor snelle, niet-destructieve en labelvrije regionale celdichtheids- en levensvatbaarheidsmeting binnen 3D-tumoraggregaten. Bevindingen onthulden een celdichtheidsgradiënt, met hogere celdichtheden in kerngebieden dan buitenste lagen in ontwikkelende aggregaten en overwegend perifere celdood in HER2 + aggregaten behandeld met Trastuzumab.
Abstract
Meercellige tumorsferoïde (MCTSs) modellen hebben een toenemend nut aangetoond voor in vitro studie van kankerprogressie en medicijnontdekking. Deze relatief eenvoudige avasculaire constructies bootsen belangrijke aspecten van in vivo tumoren na, zoals 3D-structuur en pathofysiologische gradiënten. MCTSS-modellen kunnen inzicht geven in het gedrag van kankercellen tijdens de ontwikkeling van sferoïden en als reactie op geneesmiddelen; hun vereiste omvang beperkt echter drastisch de instrumenten die worden gebruikt voor niet-destructieve beoordeling. Optische coherentie Tomografie structurele beeldvorming en Imaris 3D-analysesoftware worden onderzocht voor snelle, niet-destructieve en labelvrije meting van regionale celdichtheid binnen MCTS’en. Deze aanpak wordt gebruikt om MCTS’en te beoordelen gedurende een rijpingsperiode van 4 dagen en gedurende een verlengde 5-daagse behandeling met Trastuzumab, een klinisch relevant anti-HER2-medicijn. In het kort werden AU565 HER2 + borstkanker MCTS’en gemaakt via vloeibare overlay met of zonder de toevoeging van Matrigel (een keldermembraanmatrix) om aggregaten van verschillende morfologieën te onderzoeken (respectievelijk dikkere, schijfachtige 2,5D-aggregaten of platte 2D-aggregaten). Celdichtheid binnen het buitenste gebied, overgangsgebied en binnenkern werd gekarakteriseerd in gerijpte MCTS’en, wat een celdichtheidsgradiënt onthult met hogere celdichtheden in kerngebieden in vergelijking met buitenste lagen. De matrixtoevoeging herverdeelde de celdichtheid en verbeterde deze gradiënt, waardoor de buitenste zonedichtheid afnam en de celverdichting in de kernen toenam. De celdichtheid werd gekwantificeerd na medicamenteuze behandeling (0 h, 24 h, 5 dagen) binnen progressief diepere zones van 100 μm om potentiële regionale verschillen in geneesmiddelrespons te beoordelen. Tegen het laatste tijdspunt leek bijna alle celdood beperkt te zijn tot de buitenste 200 μm van elk aggregaat, terwijl cellen dieper in het aggregaat grotendeels onaangetast leken, wat regionale verschillen in de geneesmiddelrespons illustreert, mogelijk als gevolg van beperkingen in medicijnpenetratie. Het huidige protocol biedt een unieke techniek om de regionale celdichtheid in dichte cellulaire weefsels niet-destructief te kwantificeren en longitudinaal te meten.
Introduction
Onderzoekers hebben zich grotendeels gewend tot benchtop 3D-cultuur in vitro systemen om enkele van de belangrijkste kenmerken van tumorprogressie te bestuderen. Veel van dit onderzoek is geleid door de heropleving van meercellige tumorsferoïden (MCTS’en) en complexere organoïden 1,2. Hoewel deze modellen avasculair zijn, bieden ze een krachtig hulpmiddel voor het samenvatten van fysiologische en pathologische processen die in vivo plaatsvinden 3,4,5. Met name middelgrote modellen (diameter 300-500 μm) kunnen belangrijke tumorkenmerken nabootsen, zoals 3D-structuur, pathofysiologische gradiënten en gemetastaseerde signalering als gevolg van hypoxie in de kern. Het is goed gedocumenteerd dat deze modellen de karakteristieke concentrische lagen vertonen die worden gezien in gevasculariseerde in vivo tumoren, namelijk een buitenste laag proliferatieve cellen, een overgangslaag van senescente / rustende cellen en cellen met hypoxie in de kern 3,6,7,8,9 . Uniek inzicht kan worden verkregen uit deze modellen door celgedrag binnen deze lagen, tijdens de ontwikkeling en in reactie op het medicijn te karakteriseren. De vereiste MCTS-grootte, die nodig is om de gradiënten te ontwikkelen die ze zulke krachtige in vitro modellen maken, beperkt echter drastisch de hulpmiddelen die worden gebruikt voor niet-destructieve beoordeling. Inderdaad, een van de grootste uitdagingen met niet-destructieve analyse van MTCS’en is het kwantificeren van details op celschaal. Bright-field en fasecontrastmicroscopie worden routinematig gebruikt om de groei en ontwikkeling van 3D MCTSs niet-destructief te beoordelen. Deze modaliteiten zijn echter beperkt tot 2D-projecties en missen de capaciteit om de cruciale 3D-structuur van deze modellen te visualiseren 10,11,12,13. Informatie over cytotoxiciteit en celproliferatie wordt doorgaans verzameld via fluorescerende beeldvorming (d.w.z. light-sheet microscopie, confocale microscopie) of ex vivo immunohistologische kleuring 14,15,16. Hoewel deze benaderingen waardevolle informatie met hoge resolutie bieden over weefselstructuur, cellulaire dichtheid en cellulaire functie, vereisen ze vaak monstervoorbereiding zoals optische clearing, fixatie / kleuring of inbedding die longitudinale analyses voorkomt.
Optical Coherence Tomography (OCT) is een niet-destructieve structurele beeldvormingsmodaliteit die het potentieel heeft om enkele van de bovengenoemde uitdagingen te overwinnen. Het beschikt over cellulaire resolutie en een voldoende breed gezichtsveld (tot 10 mm x 10 mm) dat in staat is om volledige meercellige aggregaten 17,18,19 te visualiseren. Belangrijk is dat vanwege de zichtbare aard van het gebruikte licht, deze techniek volledig niet-destructief en labelvrij is17. Ook kunnen monsters in situ worden afgebeeld zonder monstervoorbereiding, zodat monsters rechtstreeks uit de incubator kunnen worden genomen, snel kunnen worden gescand met OCT (scanduur ~ 5-10 min) en vervolgens kunnen worden teruggebracht naar de incubator, waardoor longitudinale karakterisering mogelijk is. Veel studies die OCT willen gebruiken om het gedrag van tumorsferoïden te analyseren, zijn onlangs naar voren gekomen. In een van de meest opwindende demonstraties gebruikten Huang et al. OCT om niet-destructief necrotische kernen te detecteren in grote tumorsferoïde modellen, waarbij ze opmerkten dat levende en dode celgebieden waarneembare verschillen in optische verzwakking hebben, die kunnen worden gebruikt voor labelvrije levensvatbaarheidsmonitoring20. Evenzo voerden Hari et al. refractieve index (RI) metingen uit van menselijke darmkanker (HCT116) sferoïden afgebeeld met OCT om de aanwezigheid van hypoxie in de monsters te bestuderen21. Hun metingen waren niet voldoende voor directe gevolgtrekkingen, hoewel ze wel een lagere RI waarnamen op locaties die correleerden met de site, hoewel niet de grootte, van necrotische kernen, later geïdentificeerd via confocale microscopie. Abd El-Sadek et al. gebruikten OCT om de regionale levensvatbaarheid van borstkankertumormodellen te visualiseren en te kwantificeren22. Ze rapporteerden twee OCT-gebaseerde methoden voor het visualiseren van weefseldynamica en toonden een matige correlatie tussen verschillen in deze statistieken en microscopie-geïdentificeerde regio’s van levende / dode cellen.
Ons gepubliceerde werk met oct bouwde voort op deze eerdere literatuur om een kwantitatieve, niet-destructieve benadering vast te stellen om de 3D-morfologie en celtelling binnen MCTSs borstkankermodellen te meten tijdens de ontwikkeling10,23. Met behulp van Imaris 3D rendering beeldanalysesoftware om het aantal objecten ter grootte van een cel (d.w.z. vlekken) te tellen dat in beeld werd gebracht binnen de OCT-volumescans, werden de celtellingen niet-destructief gemeten in MCTS’en die statistisch vergelijkbaar waren met die bepaald via hemocytometer bij geaggregeerde dissociatie. Vanwege de structurele aard van OCT kunnen celmembranen die nog steeds aanwezig zijn na celdood door necrose echter ten onrechte worden geteld als levende cellen. Bovendien werd deze karakterisering uitgebreid tot het niet-destructief volgen van de levensvatbaarheid van cellen binnen individuele aggregaten onderworpen aan een medicijnregime met veelbelovend succes10. Belangrijk is dat werd opgemerkt dat vergelijkbare levensvatbaarheid van cellen werd gerapporteerd vanuit onze OCT-Imaris-benadering met wat werd gebenchmarkt in deze monsters bij dissociatie. Deze niet-destructieve en labelvrije celbenadering maakt het mogelijk om cellen te tellen binnen 3D-constructies en dichte aggregaten in de lengterichting zonder de construct / aggregaatstructuur op te offeren.
Het huidige werk rapporteert een verbeterde aanpak om de regionale celdichtheid binnen dichte aggregaten direct te kwantificeren door gebruik te maken van het vermogen van OCT-Imaris om zowel de morfologie van 3D-aggregaten als het celgetal te meten. Deze methodologische vooruitgang biedt een gedetailleerder beeld van de ruimtelijke verdeling en proliferatie van cellen binnen de karakteristieke concentrische lagen van MCTSs-modellen. In plaats van simpelweg een totale gemiddelde geaggregeerde celdichtheid te berekenen, kunnen dergelijke lokale dichtheidsmetingen celdichtheidsgradiënten onthullen, zoals die geassocieerd met verdichting. Deze regionale beoordeling wordt ook toegepast op aggregaten die worden behandeld met een chemotherapeuticum om de regionale geneesmiddelrespons te beoordelen, zoals gemeten door veranderingen in de lokale celdichtheid. Deze combinatie van OCT- en geavanceerde beeldvormingsanalysemethoden biedt kwantificering van de levensvatbaarheid van regionale cellen, die kan worden gebruikt om de penetratie van geneesmiddelen te onderzoeken op basis van welke regio’s een afname van de celdichtheid ervaren. Dit is het eerste rapport dat de regionale celdichtheid en levensvatbaarheid niet-destructief kwantificeert als reactie op het medicijn in dichte cellulaire weefsels en het longitudinaal meet. Een dergelijke karakterisering van driedimensionale celdichtheid en ruimtelijke verdeling door hele MCTS’en kan helpen de medicijnafgifte bij de behandeling van kanker te optimaliseren en het begrip van de progressie van het kankermodel te verbeteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Betekenis
Meercellige tumorsferoïden (MCTS’en) zijn krachtige 3D in vitro modellen voor het bestuderen van tumorprogressie en medicijnscreening 1,2,3. Het bevorderen van het nut van deze relatief eenvoudige geaggregeerde modellen is sterk afhankelijk van de karakterisering van hun belangrijkste kenmerken, zoals morfologie en celdichtheid, waarvan bekend is dat ze zowel de progressie van tumormodelle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door NIH R01 BRG CA207725 (MB/DTC) en NIH R01 CA233188 (MB). We willen AMC Apotheek bedanken voor de Trastuzumab die voor deze experimenten is geleverd.
Materials
| 96 well plates | Greiner Bio-One | 650970 | CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/ |
| 0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| AU565 breast cancer cells | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| FIJI software | open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267151B | |
| Imaris image analysis software | Bitplane | Current version 9.8 | |
| L-glutamine | Lonza | 17-605E | |
| Matrigel | Corning | 354263 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | ||
| Microscope | Zeiss | Z1 AxioVision | |
| Penicilin streptomycin | Corning | 30-0002CI | |
| Plate centrifuge | Eppendorf | ||
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| Spectral Domain Optical Coherence Tomography | ThorLabs | TEL220C1 | |
| T75 cell culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Trastuzumab | Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy. |
References
- Sutherland, R., JA, M., Inch, W. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. Journal of the National Cancer Institute. 46 (1), 113-120 (1971).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Analytical Biochemistry. 437 (1), 17-19 (2013).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Jiang, Y., Pjesivac-Grbovic, J., Cantrell, C., Freyer, J. P. A multiscale model for avascular tumor growth. Biophysical Journal. 89 (6), 3884-3894 (2005).
- Freyei, J. P., Sutherland, R. M. Regulation of growth saturation and development of necrosisin EMT6/R0 multicellular spheroids by the glucose and oxygen supply. Cancer Research. 46 (7), 3504-3512 (1986).
- Desoize, B., Jardillier, J. C. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical Reviews in Oncology Hematology. 36 (2-3), 193-207 (2000).
- Mellor, H. R., Ferguson, D. J. P., Callaghan, R. A model of quiescent tumour microregions for evaluating multicellular resistance to chemotherapeutic drugs. British Journal of Cancer. 93 (3), 302-309 (2005).
- Roberge, C. L., et al. Non-destructive tumor aggregate morphology and viability quantification at cellular resolution, during development and in response to drug. Acta Biomaterialia. 117, 322-334 (2020).
- Piccinini, F., Tesei, A., Bevilacqua, A. Single-image based methods used for non-invasive volume estimation of cancer spheroids a practical assessing approach based on entry-level equipment. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 135, 51-60 (2016).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 1-13 (2018).
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7 (9), 819-830 (2012).
- Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integrative Biology. 3 (1), 31-38 (2011).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography HHS public access. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
- Zhong, H. Q., et al. Enhancement of permeability of glycerol with ultrasound in human normal and cancer breast tissues in vitro using optical coherence tomography. Laser Physics Letters. 7 (5), 388-395 (2010).
- Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), (2016).
- Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).
- Hari, N., Patel, P., Ross, J., Hicks, K., Vanholsbeeck, F. Optical coherence tomography complements confocal microscopy for investigation of multicellular tumour spheroids. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- El-Sadek, I. A., et al. Three-dimensional dynamics optical coherence tomography for tumor spheroid evaluation. Biomedical Optics Express. 12 (11), 6844 (2021).
- Kingsley, D. M., et al. Laser-based 3D bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies. Acta Biomateralia. 95, 357-370 (2019).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Roberge, C. L., Rudkouskaya, A., Barroso, M., Corr, D. T. Longitudinal, label-free assessment of cell density and viability in multicellular tumor spheroids via optical coherence tomography. Summer Biomechanics, Bioengineering, and Biotransport Conference. , (2020).
- Bellotti, C., Duchi, S., Bevilacqua, A., Lucarelli, E., Piccinini, F. Long term morphological characterization of mesenchymal stromal cells 3D spheroids built with a rapid method based on entry-level equipment. Cytotechnology. 68 (6), 2479-2490 (2016).
- Noto, A., et al. Stearoyl-CoA desaturase-1 is a key factor for lung cancer-initiating cells. Cell Death & Disease. 4 (12), 947 (2013).
- Riffle, S., Hegde, R. S. Modeling tumor cell adaptations to hypoxia in multicellular tumor spheroids. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 36, 102 (2017).
- Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11, 393-410 (2011).
- Grimes, D. R., Kelly, C., Bloch, K., Partridge, M. A method for estimating the oxygen consumption rate in multicellular tumour spheroids. Journal of the Royal Society Interface. 11 (92), 20131124 (2014).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Pozzi, S., et al. Meet me halfway: Are in vitro 3D cancer models on the way to replace in vivo models for nanomedicine development. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113760 (2021).
- . High throughput screening format identifies synthetic mimics of matrigel for tubulogenesis screening Available from: https://abstracts.biomaterials.org/data/papers/2015/abstracts/547.pdf (2015)
- Duchnowska, R., Szczylik, C. Central nervous system metastases in breast cancer patients administered trastuzumab. Cancer Treatment Reviews. 31 (4), 312-318 (2005).
- Zazo, S., et al. Generation, characterization, and maintenance of trastuzumab-resistant HER2+ breast cancer cell lines. American Journal of Cancer Research. 6 (11), 2661-2678 (2016).
