הערכה לא הרסנית של צפיפות תאים אזורית בתוך אגרגטים סרטניים בעקבות טיפול תרופתי
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מפתח טכניקה מבוססת תמונה למדידת צפיפות תאים אזורית מהירה, לא הרסנית ונטולת תוויות בתוך אגרגטים של גידולים תלת-ממדיים. הממצאים חשפו שיפוע של צפיפות תאים, עם צפיפות תאים גבוהה יותר באזורי ליבה מאשר שכבות חיצוניות באגרגטים מתפתחים ומוות בעיקר של תאים היקפיים באגרגטים HER2+ שטופלו בטרסטוזומאב.
Abstract
מודלים של ספרואידים של גידולים רב-תאיים (MCTSs) הדגימו תועלת גוברת למחקר במבחנה של התקדמות הסרטן וגילוי תרופות. המבנים האווסקולריים הפשוטים יחסית האלה מחקים היבטים מרכזיים של גידולי in vivo , כגון מבנה תלת-ממדי ושיפועים פתופיזיולוגיים. מודלים של MCTSs יכולים לספק תובנות על התנהגות תאי סרטן במהלך התפתחות הספרואידים ובתגובה לתרופות; עם זאת, גודלם הנדרש מגביל באופן דרסטי את הכלים המשמשים להערכה לא הרסנית. קוהרנטיות אופטית טומוגרפיה הדמיה מבנית ותוכנת ניתוח תלת-ממד של אימאריס נחקרות למדידה מהירה, לא הרסנית ונטולת תוויות של צפיפות תאים אזורית בתוך MCTSs. גישה זו משמשת להערכת MCTS במהלך תקופת התבגרות של 4 ימים ולאורך טיפול ממושך של 5 ימים עם Trastuzumab, תרופה רלוונטית מבחינה קלינית נגד HER2. בקצרה, MCTS של סרטן השד AU565 HER2+ נוצרו באמצעות שכבת-על נוזלית עם או בלי תוספת של Matrigel (מטריצת ממברנת מרתף) כדי לחקור אגרגטים של מורפולוגיות שונות (אגרגטים עבים יותר, דמויי דיסק 2.5D או אגרגטים דו-ממדיים שטוחים, בהתאמה). צפיפות התא בתוך האזור החיצוני, אזור המעבר והליבה הפנימית התאפיינה ב-MCTS שהבשילו, וחשפו שיפוע של צפיפות תאים עם צפיפות תאים גבוהה יותר באזורי הליבה בהשוואה לשכבות החיצוניות. תוספת המטריצה חילקה מחדש את צפיפות התאים ושיפרה את השיפוע הזה, תוך הפחתת צפיפות האזור החיצוני והגברת דחיסת התאים בליבות. צפיפות התאים כומתה לאחר טיפול תרופתי (0 שעות, 24 שעות, 5 ימים) בתוך אזורים עמוקים יותר ויותר של 100 מיקרומטר כדי להעריך הבדלים אזוריים פוטנציאליים בתגובה לתרופות. בנקודת הזמן האחרונה, נראה היה שכמעט כל מקרי המוות של התאים מוגבלים ל-200 מיקרומטר החיצוניים של כל צבירה, בעוד שתאים עמוקים יותר במצטבר נראו ברובם לא מושפעים, מה שממחיש הבדלים אזוריים בתגובה לתרופות, אולי בגלל מגבלות בחדירת הסמים. הפרוטוקול הנוכחי מספק טכניקה ייחודית לכימות לא הרסני של צפיפות התאים האזורית בתוך רקמות תאיות צפופות ולמדוד אותה לאורך.
Introduction
חוקרים פנו במידה רבה למערכות במבחנה של תרבית תלת-ממדית כדי לחקור כמה מתכונות המפתח של התקדמות הגידול. חלק גדול ממחקר זה הובל על ידי הופעתם מחדש של כדוריות גידול רב-תאיות (MCTSs) ואורגנואידים מורכבים יותר 1,2. למרות שמודלים אלה הם avascular, הם מספקים כלי רב עוצמה לסיכום תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים המתרחשים in vivo 3,4,5. בפרט, מודלים בינוניים (קוטר 300-500 מיקרומטר) יכולים לחקות תכונות גידול מרכזיות כגון מבנה תלת-ממדי, גרדיאנטים פתופיזיולוגיים ואיתות גרורתי עקב היפוקסיה בתוך הליבה. מתועד היטב כי מודלים אלה מציגים את השכבות הקונצנטריות האופייניות שנראו בגידולי in vivo וסקולריים, כלומר שכבה חיצונית של תאים מתרבים, שכבת מעבר של תאים סנסנטיים/קוויזנטיים, ותאים החווים היפוקסיה בליבת 3,6,7,8,9 . ניתן להפיק תובנות ייחודיות ממודלים אלה על ידי אפיון התנהגות התאים בתוך שכבות אלה, במהלך ההתפתחות ובתגובה לתרופה. עם זאת, גודל ה- MCTS הנדרש, הדרוש לפיתוח הדרגות שהופכות אותם למודלים חזקים כל כך במבחנה, מגביל באופן דרסטי את הכלים המשמשים להערכה לא הרסנית. ואכן, אחד האתגרים הגדולים ביותר בניתוח לא הרסני של MTCS הוא כימות פרטים בקנה מידה של תאים. מיקרוסקופיית שדה בהיר וניגודיות פאזה משמשת באופן שגרתי להערכת צמיחה והתפתחות של MCTS תלת-ממדיים באופן לא הרסני. עם זאת, אופנות אלה מוגבלות לתחזיות דו-ממדיות, וחסרות את היכולת לדמיין את המבנה התלת-ממדי החיוני של מודלים אלה 10,11,12,13. מידע על ציטוטוקסיות והתפשטות תאים נאסף בדרך כלל באמצעות הדמיה פלואורסצנטית (כלומר, מיקרוסקופיה של יריעות אור, מיקרוסקופיה קונפוקלית) או צביעה אימונוהיסטולוגית ex vivo 14,15,16. בעוד שגישות אלה מספקות מידע רב ערך ברזולוציה גבוהה על מבנה הרקמה, צפיפות התאים ותפקוד התאים, לעתים קרובות הן דורשות הכנת דגימות כגון ניקוי אופטי, תיקון/צביעה או הטבעה המונעת ניתוחים אורכיים.
טומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית (OCT) היא שיטת הדמיה מבנית לא הרסנית שיש לה פוטנציאל להתגבר על כמה מהאתגרים שהוזכרו לעיל. הוא מתהדר ברזולוציה תאית ובשדה ראייה רחב מספיק (עד 10 מ”מ x 10 מ”מ) המסוגל לדמיין אגרגטים רב-תאיים שלמיםבגודל 17,18,19. חשוב לציין, בשל האופי הנראה של האור שבו נעשה שימוש, טכניקה זו היא לחלוטין לא הרסנית ונטולת תוויות17. כמו כן, ניתן לצלם דגימות באתרן ללא צורך בהכנת דגימה, כך שניתן לקחת דגימות היישר מהאינקובטור, לסרוק במהירות עם OCT (משך הסריקה ~ 5-10 דקות), ואז להחזיר לאינקובטור, מה שמאפשר אפיון אורכי. מחקרים רבים המבקשים להשתמש ב- OCT כדי לנתח התנהגות ספרואידית של גידולים צצו לאחרונה. באחת ההדגמות המרגשות ביותר, Huang et al. השתמשו ב-OCT כדי לזהות באופן לא הרסני ליבות נמקיות בתוך מודלים כדוריים גדולים של גידולים, וציינו כי באזורי תאים חיים ומתים יש הבדלים ניכרים בהנחתה אופטית, אשר עשויים לשמש לניטור כדאיות ללא תווית20. באופן דומה, Hari et al. ערכו מדידות של מקדם שבירה (RI) של כדוריות של סרטן המעי הגס האנושי (HCT116) שצולמו עם OCT כדי לחקור את נוכחותה של היפוקסיה בתוך הדגימות21. המדידות שלהם לא הספיקו להסקת מסקנות ישירות, אם כי הם כן צפו ב-RI נמוך יותר במיקומים שקושרו לאתר, אם כי לא לגודל, של ליבות נמקיות, שזוהו מאוחר יותר באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. עבד אל-סאדק ואחרים השתמשו ב-OCT כדי לדמיין ולכמת את כדאיות הרקמות האזורית של מודלים של גידולי סרטן שד22. הם דיווחו על שתי שיטות מבוססות OCT להדמיית דינמיקה של רקמות והראו מתאם מתון בין הבדלים במדדים אלה לבין אזורים שזוהו על ידי מיקרוסקופיה של תאים חיים/מתים.
העבודה שלנו שפורסמה באמצעות OCT התבססה על ספרות קודמת זו כדי לבסס גישה כמותית ולא הרסנית למדידת המורפולוגיה התלת-ממדית וספירת התאים במודלים של סרטן השד MCTSs במהלך הפיתוח10,23. באמצעות תוכנת ניתוח תמונות לעיבוד תמונה בתלת-ממד של Imaris כדי לספור את מספר העצמים בגודל התא (כלומר, כתמים) שצולמו בתוך סריקות נפח OCT, ספירות התאים נמדדו באופן לא הרסני ב-MCTS שהיו דומים סטטיסטית לאלה שנקבעו באמצעות המוציטומטר בעת דיסוציאציה מצטברת. עם זאת, בשל האופי המבני של OCT, קרומי התאים שעדיין קיימים לאחר מוות תאי על ידי נמק עשויים להיספר בטעות כתאים חיים. יתר על כן, אפיון זה הורחב למעקב לא הרסני אחר כדאיות התאים בתוך אגרגטים בודדים הנתונים למשטר תרופות עם הצלחה מבטיחה10. חשוב לציין כי כדאיות דומה של תאים דווחה מגישת OCT-Imaris שלנו עם מה שנבחן בדגימות אלה לאחר הדיסוציאציה. גישה זו של תאים לא הרסניים ונטולי תוויות מאפשרת לספור את התאים בתוך מבנים תלת-ממדיים ואגרגטים צפופים לאורך מבלי להקריב את המבנה/מבנה הצבירה.
העבודה הנוכחית מדווחת על גישה משופרת לכימות ישיר של צפיפות התאים האזורית בתוך אגרגטים צפופים על ידי מינוף היכולת של OCT-Imaris למדוד הן את המורפולוגיה של הצבר התלת-ממדי והן את מספר התאים. התקדמות מתודולוגית זו מספקת תמונה מפורטת יותר של ההתפלגות המרחבית של התאים והתפשטותם בתוך השכבות הקונצנטריות האופייניות למודלים של MCTSs. במקום פשוט לחשב את צפיפות התאים המצטברת הממוצעת הכוללת, מדידות צפיפות מקומיות כאלה יכולות לחשוף גרדיאנטים של צפיפות תאים, כגון אלה הקשורים לדחיסה. הערכה אזורית זו מיושמת גם על אגרגטים שטופלו בכימותרפיה כדי להעריך את התגובה האזורית לתרופות, כפי שנמדדה על ידי שינויים בצפיפות התאים המקומית. שילוב זה של OCT ושיטות ניתוח הדמיה מתקדמות מספק כימות של כדאיות תאים אזורית, אשר ניתן להשתמש בה כדי לחקור את חדירת התרופות על סמך אילו אזורים חווים ירידה בצפיפות התאים. זהו הדו”ח הראשון שמכומת באופן לא הרסני את צפיפות התאים האזורית ואת הכדאיות שלהם בתגובה לתרופה בתוך רקמות תאיות צפופות ומודד אותה לאורך. אפיון כזה של צפיפות תאים תלת-ממדית והתפלגות מרחבית לאורך MCTS שלמים עשוי לסייע באופטימיזציה של אספקת תרופות בטיפול בסרטן ולשפר את ההבנה של התקדמות מודל הסרטן.
Protocol
Representative Results
Discussion
משמעות
כדוריות גידול רב-תאיות (MCTSs) הן מודלים תלת-ממדיים חזקים במבחנה לחקר התקדמות הגידול ובדיקת תרופות 1,2,3. קידום התועלת של מודלים מצטברים פשוטים יחסית אלה מסתמך במידה רבה על אפיון התכונות העיקריות שלהם, כגון מורפולוגיה ו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי NIH R01 BRG CA207725 (MB/DTC) ו-NIH R01 CA233188 (MB). ברצוננו להודות לבית המרקחת AMC על הטרסטוזומאב שסופק לניסויים אלה.
Materials
| 96 well plates | Greiner Bio-One | 650970 | CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/ |
| 0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| AU565 breast cancer cells | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| FIJI software | open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267151B | |
| Imaris image analysis software | Bitplane | Current version 9.8 | |
| L-glutamine | Lonza | 17-605E | |
| Matrigel | Corning | 354263 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | ||
| Microscope | Zeiss | Z1 AxioVision | |
| Penicilin streptomycin | Corning | 30-0002CI | |
| Plate centrifuge | Eppendorf | ||
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| Spectral Domain Optical Coherence Tomography | ThorLabs | TEL220C1 | |
| T75 cell culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Trastuzumab | Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy. |
References
- Sutherland, R., JA, M., Inch, W. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. Journal of the National Cancer Institute. 46 (1), 113-120 (1971).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Analytical Biochemistry. 437 (1), 17-19 (2013).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Jiang, Y., Pjesivac-Grbovic, J., Cantrell, C., Freyer, J. P. A multiscale model for avascular tumor growth. Biophysical Journal. 89 (6), 3884-3894 (2005).
- Freyei, J. P., Sutherland, R. M. Regulation of growth saturation and development of necrosisin EMT6/R0 multicellular spheroids by the glucose and oxygen supply. Cancer Research. 46 (7), 3504-3512 (1986).
- Desoize, B., Jardillier, J. C. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical Reviews in Oncology Hematology. 36 (2-3), 193-207 (2000).
- Mellor, H. R., Ferguson, D. J. P., Callaghan, R. A model of quiescent tumour microregions for evaluating multicellular resistance to chemotherapeutic drugs. British Journal of Cancer. 93 (3), 302-309 (2005).
- Roberge, C. L., et al. Non-destructive tumor aggregate morphology and viability quantification at cellular resolution, during development and in response to drug. Acta Biomaterialia. 117, 322-334 (2020).
- Piccinini, F., Tesei, A., Bevilacqua, A. Single-image based methods used for non-invasive volume estimation of cancer spheroids a practical assessing approach based on entry-level equipment. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 135, 51-60 (2016).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 1-13 (2018).
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7 (9), 819-830 (2012).
- Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integrative Biology. 3 (1), 31-38 (2011).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography HHS public access. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
- Zhong, H. Q., et al. Enhancement of permeability of glycerol with ultrasound in human normal and cancer breast tissues in vitro using optical coherence tomography. Laser Physics Letters. 7 (5), 388-395 (2010).
- Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), (2016).
- Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).
- Hari, N., Patel, P., Ross, J., Hicks, K., Vanholsbeeck, F. Optical coherence tomography complements confocal microscopy for investigation of multicellular tumour spheroids. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- El-Sadek, I. A., et al. Three-dimensional dynamics optical coherence tomography for tumor spheroid evaluation. Biomedical Optics Express. 12 (11), 6844 (2021).
- Kingsley, D. M., et al. Laser-based 3D bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies. Acta Biomateralia. 95, 357-370 (2019).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Roberge, C. L., Rudkouskaya, A., Barroso, M., Corr, D. T. Longitudinal, label-free assessment of cell density and viability in multicellular tumor spheroids via optical coherence tomography. Summer Biomechanics, Bioengineering, and Biotransport Conference. , (2020).
- Bellotti, C., Duchi, S., Bevilacqua, A., Lucarelli, E., Piccinini, F. Long term morphological characterization of mesenchymal stromal cells 3D spheroids built with a rapid method based on entry-level equipment. Cytotechnology. 68 (6), 2479-2490 (2016).
- Noto, A., et al. Stearoyl-CoA desaturase-1 is a key factor for lung cancer-initiating cells. Cell Death & Disease. 4 (12), 947 (2013).
- Riffle, S., Hegde, R. S. Modeling tumor cell adaptations to hypoxia in multicellular tumor spheroids. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 36, 102 (2017).
- Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11, 393-410 (2011).
- Grimes, D. R., Kelly, C., Bloch, K., Partridge, M. A method for estimating the oxygen consumption rate in multicellular tumour spheroids. Journal of the Royal Society Interface. 11 (92), 20131124 (2014).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Pozzi, S., et al. Meet me halfway: Are in vitro 3D cancer models on the way to replace in vivo models for nanomedicine development. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113760 (2021).
- . High throughput screening format identifies synthetic mimics of matrigel for tubulogenesis screening Available from: https://abstracts.biomaterials.org/data/papers/2015/abstracts/547.pdf (2015)
- Duchnowska, R., Szczylik, C. Central nervous system metastases in breast cancer patients administered trastuzumab. Cancer Treatment Reviews. 31 (4), 312-318 (2005).
- Zazo, S., et al. Generation, characterization, and maintenance of trastuzumab-resistant HER2+ breast cancer cell lines. American Journal of Cancer Research. 6 (11), 2661-2678 (2016).
