El presente protocolo describe un método para extraer vesículas extracelulares de la sangre periférica y tejidos sólidos con el posterior perfil de antígenos de superficie y cargas de proteínas.
Las vesículas extracelulares (EV) circulantes y residentes en tejidos representan objetivos prometedores como nuevos biomarcadores teranósticos, y emergen como actores importantes en el mantenimiento de la homeostasis del organismo y la progresión de un amplio espectro de enfermedades. Si bien la investigación actual se centra en la caracterización de exosomas endógenos con origen endosomal, las microvesículas que brotan de la membrana plasmática han ganado cada vez más atención en la salud y la enfermedad, que se caracterizan por una gran cantidad de moléculas de superficie que recapitulan la firma de membrana de las células madre. Aquí, se presenta un procedimiento reproducible basado en la centrifugación diferencial para extraer y caracterizar EVs del plasma y tejidos sólidos, como el hueso. El protocolo describe además el perfil posterior de antígenos de superficie y cargas de proteínas de EV, que por lo tanto son trazables para sus derivaciones e identificados con componentes relacionados con la función potencial. Este método será útil para el análisis correlativo, funcional y mecanicista de EV en estudios biológicos, fisiológicos y patológicos.
Se han propuesto vesículas extracelulares (EV) para definir estructuras extracelulares liberadas por la bicapa lipídica liberada por células1, que desempeñan un papel importante en diversos eventos fisiológicos y patológicos2. Los EV liberados por las células sanas se pueden dividir ampliamente en dos categorías principales, a saber, exosomas (o EV pequeños) formados a través de una vía de tráfico endocítico intracelular3 y microvesículas (o EV grandes) desarrolladas por la gemación externa de la membrana plasmática de la célula4. Mientras que muchos estudios se centran en la función de las EV recolectadas a partir de células cultivadas in vitro5, las EV derivadas de la circulación o los tejidos son más complejas y heterogéneas, lo que tiene la ventaja de reflejar el verdadero estado del organismo in vivo6. Además, casi todos los tipos de tejidos pueden producir EVs in vivo , y estos EVs pueden actuar como mensajeros dentro del tejido o ser transferidos por diversos fluidos corporales, especialmente la sangre periférica, para facilitar la comunicación sistémica7. Las EV en la circulación y los tejidos también son objetivos para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades8.
Mientras que los exosomas han sido intensamente estudiados en los últimos años, las microvesículas también tienen importantes funciones biológicas, que pueden ser fácilmente extraídas sin ultracentrifugación, promoviendo así la investigación básica y clínica9. En particular, una cuestión crítica con respecto a las EV aisladas de la circulación y los tejidos es que se derivan de diferentes tipos de células10. Dado que las microvesículas son expulsadas de la membrana plasmática y se caracterizan por una abundancia de moléculas de superficie celular9, es factible utilizar marcadores de membrana celular parental para identificar el origen celular de estas EV. Específicamente, la técnica de citometría de flujo (FC) se puede aplicar para detectar marcadores de membrana. Además, los investigadores pueden aislar los vehículos eléctricos y realizar análisis adicionales basados en las cargas funcionales.
El presente protocolo proporciona un procedimiento exhaustivo para extraer y caracterizar EV de muestras in vivo. Los EV se aíslan mediante centrifugación diferencial, y la caracterización de los EV incluye la identificación morfológica mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y microscopía electrónica de transmisión (TEM), análisis de origen a través de FC y análisis de carga de proteínas mediante western blot. El plasma sanguíneo y el hueso maxilar de los ratones se utilizan como representantes. Los investigadores pueden consultar este protocolo para vehículos eléctricos de otras fuentes y realizar las modificaciones correspondientes.
Al estudiar las características, el destino y la función de los vehículos eléctricos, es crucial aislar los vehículos eléctricos con alto rendimiento y baja contaminación. Existen varios métodos para extraer EVs, como la centrifugación por gradiente de densidad (DGC), la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y los ensayos de inmunocaptura 4,20. Aquí, se utilizó uno de los métodos más utilizados, la centrifugación diferencial; las ventajas de…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32000974, 81870796, 82170988 y 81930025) y la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2019M663986 y BX20190380). Estamos agradecidos por la asistencia del Centro Nacional de Demostración de Enseñanza Experimental para Medicina Básica (AMFU).
4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |