הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לחילוץ שלפוחיות חוץ-תאיות מהדם ההיקפי ומרקמות מוצקות עם פרופיל עוקב של אנטיגנים על פני השטח ומטעני חלבונים.
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) במחזור הדם ושוכנות רקמות מייצגות מטרות מבטיחות כסמנים ביולוגיים תרנוסטיים חדשים, והן מתגלות כשחקנים חשובים בשמירה על הומאוסטזיס אורגניזם והתקדמות של קשת רחבה של מחלות. בעוד המחקר הנוכחי מתמקד באפיון של אקסוזומים אנדוגניים עם מקור אנדוזומלי, microvesicles blebbing מן קרום פלזמה זכו לתשומת לב גוברת בבריאות וחולי, אשר מתאפיינים על ידי שפע של מולקולות פני השטח לשחזר את חתימת הממברנה של תאי הורה. כאן מוצג הליך הניתן לשחזור המבוסס על צנטריפוגה דיפרנציאלית לחילוץ ואפיון כלי רכב חשמליים מהפלזמה ומרקמות מוצקות, כגון העצם. הפרוטוקול מתאר גם פרופיל עוקב של אנטיגנים על פני השטח ומטעני חלבונים של כלי רכב חשמליים, אשר ניתן לעקוב אחר נגזרותיהם ומזוהים עם רכיבים הקשורים לתפקוד פוטנציאלי. שיטה זו תהיה שימושית לניתוח קורלטיבי, פונקציונלי ומכניסטי של כלי רכב חשמליים במחקרים ביולוגיים, פיזיולוגיים ופתולוגיים.
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הוצעו כדי להגדיר מבנים חוץ-תאיים מוקפים דו-שכבתיים של שומנים בתאים1, הממלאים תפקידים חשובים באירועים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים2. ניתן לחלק באופן כללי כלי רכב חשמליים המשוחררים על ידי תאים בריאים לשתי קטגוריות עיקריות: אקסוזומים (או כלי רכב חשמליים קטנים) הנוצרים באמצעות מסלול סחר אנדוציטי תוך-תאי3 ומיקרו-שלפוחיות (או EV גדולות) המתפתחות על ידי הניצנים החיצוניים של קרום הפלזמה של תא4. בעוד שמחקרים רבים מתמקדים בתפקוד של כלי רכב חשמליים שנאספו מתאים בתרבית במבחנה5, כלי רכב חשמליים שמקורם במחזור הדם או ברקמות מורכבים והטרוגניים יותר, שיש להם יתרון בכך שהם משקפים את המצב האמיתי של האורגניזם in vivo6. יתר על כן, כמעט כל סוגי הרקמות יכולים לייצר EVs in vivo , ורכבים חשמליים אלה יכולים לפעול כשליחים בתוך הרקמה או להיות מועברים על ידי נוזלי גוף שונים, במיוחד הדם ההיקפי, כדי להקל על תקשורת מערכתית7. כלי רכב חשמליים במחזור הדם וברקמות הם גם מטרות לאבחון מחלות ולטיפול בהן8.
בעוד האקסוזומים נחקרו באופן אינטנסיבי בשנים האחרונות, למיקרו-שלפוחיות יש גם תפקידים ביולוגיים חשובים, אותם ניתן לחלץ בקלות ללא אולטרה-צנטריפוגה, ובכך לקדם מחקר בסיסי וקליני9. יש לציין כי סוגיה קריטית בנוגע לרכבים חשמליים המבודדים ממחזור הדם ומהרקמות היא שהם נגזרים מסוגי תאים שונים10. מאחר שמיקרו-שלפוחיות מובלות מממברנת הפלזמה ומוצגות על ידי שפע של מולקולות פני התא9, שימוש בסמנים של קרום תא האב כדי לזהות את המקור התאי של כלי רכב חשמליים אלה הוא אפשרי. באופן ספציפי, ניתן ליישם את טכניקת ציטומטריית הזרימה (FC) כדי לזהות סמני ממברנה. יתר על כן, החוקרים יכולים לבודד את כלי הרכב החשמליים ולבצע ניתוחים נוספים המבוססים על המטענים הפונקציונליים.
הפרוטוקול הנוכחי מספק הליך יסודי לחילוץ ואפיון כלי רכב חשמליים מדגימות in vivo. כלי הרכב החשמליים מבודדים באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית, ואפיון כלי הרכב החשמליים כולל זיהוי מורפולוגי באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM), ניתוח מקור באמצעות FC וניתוח מטעני חלבונים באמצעות כתם מערבי. פלסמת הדם והעצם המקסימלית של עכברים משמשים כנציגים. חוקרים יכולים להתייחס לפרוטוקול זה עבור כלי רכב חשמליים ממקורות אחרים ולבצע שינויים מתאימים.
כאשר בוחנים את התכונות, הגורל והתפקוד של כלי רכב חשמליים, חיוני לבודד כלי רכב חשמליים עם תפוקה גבוהה וזיהום נמוך. קיימות שיטות שונות לחילוץ כלי רכב חשמליים, כגון צנטריפוגת שיפוע צפיפות (DGC), כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) ומבחני לכידת חיסון 4,20. כאן נעשה שימו?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32000974, 81870796, 82170988 ו- 81930025) והקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (2019M663986 ו- BX20190380). אנו אסירי תודה על הסיוע של המרכז הלאומי להדגמת הוראה ניסויית לרפואה בסיסית (AMFU).
4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |