本协议描述了一种从外周血和实体组织中提取细胞外囊泡的方法,随后对表面抗原和蛋白质货物进行分析。
循环和组织驻留的细胞外囊泡(EVs)作为新型治疗诊断生物标志物代表了有希望的靶标,它们成为维持机体稳态和广泛疾病进展的重要参与者。虽然目前的研究重点是具有内体起源的内源性外泌体的特征,但从质膜中起泡的微囊泡在健康和疾病中越来越受到关注,其特征是丰富的表面分子概括了亲本细胞的膜特征。在这里,提出了一种基于差速离心的可重复程序,用于从血浆和实体组织(例如骨骼)中提取和表征EV。该协议进一步描述了电动汽车表面抗原和蛋白质货物的后续分析,因此可以追溯其衍生物,并识别与潜在功能相关的组件。该方法将有助于在生物学、生理学和病理学研究中对 EV 进行相关、功能和机理分析。
已经提出细胞外囊泡(EV)来定义细胞释放的脂质双层封闭的细胞外结构1,其在各种生理和病理事件中起重要作用2。健康细胞释放的EV大致可分为两大类,即通过细胞内内吞运输途径3形成的外泌体(或小EV)和细胞质膜向外出芽形成的微囊泡(或大EV)4。虽然许多研究集中在体外5中从培养细胞中收集的EV的功能,但来自循环或组织的EV更加复杂和异质,其优点是反映了体内生物体的真实状态6。此外,几乎所有种类的组织都可以在体内产生EV,这些EV可以作为组织内的信使或通过各种体液(尤其是外周血)转移,以促进全身交流7。循环和组织中的电动汽车也是疾病诊断和治疗的目标8。
近年来,外泌体的研究深入,微囊泡也具有重要的生物学功能,无需超速离心即可轻松提取,从而促进了基础和临床研究9。值得注意的是,关于从循环和组织中分离的EV的一个关键问题是它们来自不同的细胞类型10。由于微囊泡从质膜中吹出并具有丰富的细胞表面分子9,因此使用亲本细胞膜标记物来鉴定这些EV的细胞起源是可行的。具体而言,流式细胞术(FC)技术可用于检测膜标志物。此外,研究人员可以分离电动汽车并根据功能货物进行进一步分析。
本协议为从体内样品中提取和表征EV提供了全面的程序。EV通过差速离心分离,EV的表征包括通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)和透射电子显微镜(TEM)进行形态学鉴定,通过FC进行原产地分析,以及通过蛋白质印迹进行蛋白质货物分析。以小鼠的血浆和上颌骨为代表。研究人员可以参考其他来源的电动汽车的该协议并进行相应的修改。
在研究电动汽车的特性、命运和功能时,隔离高产量和低污染的电动汽车至关重要。有多种方法可以提取 EV,例如密度梯度离心 (DGC)、体积排阻色谱 (SEC) 和免疫捕获测定4,20。这里使用了最常用的方法之一,差速离心;这样做的优点是不耗时,它可以产生高产量的EV,易于从有限的样品中分离出来,并且能够根据所使用的样品源修改方法。为了分?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了中国国家自然科学基金(32000974,81870796,82170988和81930025)和中国博士后科学基金(2019M663986和BX20190380)的资助。我们感谢国家基础医学实验教学示范中心(AMFU)的帮助。
4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |