Il presente protocollo descrive un metodo per estrarre vescicole extracellulari dal sangue periferico e dai tessuti solidi con successiva profilazione degli antigeni di superficie e dei carichi proteici.
Le vescicole extracellulari circolanti e residenti nei tessuti (EV) rappresentano obiettivi promettenti come nuovi biomarcatori teranostici ed emergono come attori importanti nel mantenimento dell’omeostasi dell’organismo e nella progressione di un ampio spettro di malattie. Mentre la ricerca attuale si concentra sulla caratterizzazione degli esosomi endogeni di origine endosomiale, le microvescicole che sbiancano dalla membrana plasmatica hanno guadagnato crescente attenzione nella salute e nella malattia, che sono caratterizzate da un’abbondanza di molecole superficiali che ricapitolano la firma della membrana delle cellule madri. Qui viene presentata una procedura riproducibile basata sulla centrifugazione differenziale per estrarre e caratterizzare le EV dal plasma e dai tessuti solidi, come l’osso. Il protocollo descrive inoltre la successiva profilazione degli antigeni di superficie e dei carichi proteici delle EV, che sono quindi tracciabili per le loro derivazioni e identificati con componenti correlate alla funzione potenziale. Questo metodo sarà utile per l’analisi correlata, funzionale e meccanicistica delle EV in studi biologici, fisiologici e patologici.
Le vescicole extracellulari (EV) sono state proposte per definire strutture extracellulari a doppio strato lipidico rilasciate dalle cellule1, che svolgono ruoli importanti in vari eventi fisiologici e patologici2. Le EV rilasciate da cellule sane possono essere ampiamente suddivise in due categorie principali, vale a dire esosomi (o piccole EV) formati attraverso una via di traffico endocitico intracellulare3 e microvescicole (o grandi EV) sviluppate dal germogliamento verso l’esterno della membrana plasmatica della cellula4. Mentre molti studi si concentrano sulla funzione delle EV raccolte da cellule in coltura in vitro5, le EV derivate dalla circolazione o dai tessuti sono più complesse ed eterogenee, che hanno il vantaggio di riflettere il vero stato dell’organismo in vivo6. Inoltre, quasi tutti i tipi di tessuti possono produrre EV in vivo , e questi EV possono agire come messaggeri all’interno del tessuto o essere trasferiti da vari fluidi corporei, in particolare il sangue periferico, per facilitare la comunicazione sistemica7. Anche i veicoli elettrici nella circolazione e nei tessuti sono bersagli per la diagnosi e il trattamento delle malattie8.
Mentre gli esosomi sono stati intensamente studiati negli ultimi anni, le microvescicole hanno anche importanti funzioni biologiche, che possono essere facilmente estratte senza ultracentrifugazione, promuovendo così la ricerca di base e clinica9. In particolare, un problema critico per quanto riguarda le EV isolate dalla circolazione e dai tessuti è che derivano da diversi tipi di cellule10. Poiché le microvescicole sono eliminate dalla membrana plasmatica e caratterizzate da un’abbondanza di molecole della superficie cellulare9, è possibile utilizzare marcatori della membrana cellulare madre per identificare l’origine cellulare di questi EV. In particolare, la tecnica di citometria a flusso (FC) può essere applicata per rilevare marcatori di membrana. Inoltre, i ricercatori possono isolare i veicoli elettrici e fare ulteriori analisi basate sui carichi funzionali.
Il presente protocollo fornisce una procedura completa per l’estrazione e la caratterizzazione delle EV da campioni in vivo. Gli EV sono isolati tramite centrifugazione differenziale e la caratterizzazione dei veicoli elettrici include l’identificazione morfologica tramite analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM), analisi dell’origine tramite FC e analisi del carico proteico tramite western blot. Il plasma sanguigno e l’osso mascellare dei topi sono usati come rappresentanti. I ricercatori possono fare riferimento a questo protocollo per i veicoli elettrici da altre fonti e apportare le modifiche corrispondenti.
Quando si studiano le caratteristiche, il destino e la funzione dei veicoli elettrici, è fondamentale isolare i veicoli elettrici con alta resa e bassa contaminazione. Esistono vari metodi per estrarre EV, come la centrifugazione a gradiente di densità (DGC), la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) e i saggi di immunocattura 4,20. Qui è stato utilizzato uno dei metodi più comunemente usati, la centrifugazione differenziale; i vantaggi di questo sono…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (32000974, 81870796, 82170988 e 81930025) e della China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 e BX20190380). Siamo grati per l’assistenza del National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).
4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |