Imagem PET/MR não invasiva em um modelo ortotópico de carcinoma hepatocelular em camundongo
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para criar xenoenxertos de carcinoma hepatocelular ortotópico com e sem ligadura da artéria hepática e realizamos tomografia por emissão de pósitrons (PET) não invasiva de hipóxia tumoral usando [18 F]Fluoromisonidazol ([18 F]FMISO) e [18 F]Fluorodesoxiglicose ([18F]FDG).
Abstract
Modelos experimentais pré-clínicos de carcinoma hepatocelular (CHC) que recapitulam a doença humana representam uma ferramenta importante para estudar a tumorigênese e avaliar novas abordagens terapêuticas. A imagem não invasiva de corpo inteiro usando tomografia por emissão de pósitrons (PET) fornece insights críticos sobre as características in vivo dos tecidos no nível molecular em tempo real. Apresentamos aqui um protocolo para a criação de xenoenxertos ortotópicos de CHC com e sem ligadura da artéria hepática (HAL) para induzir hipóxia tumoral e a avaliação de seu metabolismo tumoral in vivo usando [18 F]Fluoromisonidazol ([18 F]FMISO) e [18F]Fluorodesoxiglicose ([18F]FDG) PET/RESSONÂNCIA MAGNÉTICA (MR) de imagem. A hipóxia tumoral pôde ser prontamente visualizada usando o marcador de hipóxia [18 F]FMISO, e verificou-se que a captação de [18 F]FMISO foi maior em camundongos com CHC submetidos a HAL do que no grupo não-HAL, enquanto [18F]FDG não conseguiu distinguir a hipóxia tumoral entre os dois grupos. Os tumores HAL também apresentaram um nível mais alto de expressão do fator induzível por hipóxia (HIF)-1α em resposta à hipóxia. A quantificação dos tumores HAL mostrou um aumento de 2,3 vezes na captação de [18F]FMISO com base na abordagem padronizada de captação de valor (SUV).
Introduction
O carcinoma hepatocelular (CHC) é o sexto câncer mais diagnosticado e a terceira causa mais comum de morte por câncer em todo o mundo, com mais de 900.000 novos casos e 800.000 mortes em 20201. O principal fator de risco é a cirrose, que ocorre como resultado de infecções virais (vírus das hepatites B e C), abuso de álcool, diabetes e esteato-hepatite não alcoólica2. O manejo do CHC é bastante complexo, e várias opções de tratamento estão disponíveis, incluindo ressecção cirúrgica, ablação térmica ou química, transplante, quimioembolização transarterial, radiação e quimioterapia, dependendo do estadiamento da doença 2,3. O CHC é um tumor refratário à quimioterapia com recorrência da doença em até 70% dos pacientes após terapia curativade intenção 2.
Apesar do alto grau de heterogeneidade tumoral, o CHC está associado a dois desfechos comuns: (i) o CHC é muito hipóxico e (ii) a hipóxia tumoral está ligada a maior agressividade tumoral e falha no tratamento. A proliferação descontrolada de células CHC resulta em uma alta taxa de consumo de oxigênio que precede a vascularização, criando assim um microambiente hipóxico. Baixos níveis intratumorais de oxigênio, em seguida, desencadeiam uma série de respostas biológicas que influenciam a agressividade do tumor e a resposta ao tratamento. Os fatores induzíveis por hipóxia (HIFs) são frequentemente reconhecidos como os reguladores transcricionais essenciais na resposta à hipóxia 2,3. Assim, a capacidade de detectar hipóxia é crucial para visualizar tecidos neoplásicos e identificar os locais inacessíveis, que requerem procedimentos invasivos. Também ajuda a entender melhor as mudanças moleculares que levam à agressividade do tumor e melhoram os resultados do tratamento do paciente.
A imagem molecular usando tomografia por emissão de pósitrons (PET) é comumente usada no diagnóstico e estadiamento de muitos tipos de câncer, incluindo o CHC. Em particular, o uso combinado de imagens PET de traçador duplo envolvendo [18 F]Fluorodesoxiglicose ([18F]FDG) e [11C]Acetato pode aumentar significativamente a sensibilidade geral no diagnóstico de CHC 4,5. A imagem da hipóxia, por outro lado, pode ser obtida usando o marcador hipóxico comumente usado [18 F]Fluoromisonidazol ([18F]FMISO). Na prática clínica, a avaliação não invasiva da hipóxia é importante para diferenciar entre vários tipos de tumores e regiões para o planejamento da radioterapia6.
A imagem pré-clínica tornou-se uma ferramenta indispensável para a avaliação não invasiva e longitudinal de modelos de camundongos para diferentes doenças. Um modelo de CHC robusto e altamente reprodutível representa uma plataforma importante para a pesquisa pré-clínica e translacional sobre a fisiopatologia do CHC humano e a avaliação de novas terapias. Juntamente com a imagem PET, os comportamentos in vivo podem ser elucidados para fornecer informações importantes no nível molecular para qualquer ponto de tempo. Aqui, descrevemos um protocolo para a geração de xenoenxertos ortotópicos de CHC de ligadura da artéria hepática (HAL) e análise de seu metabolismo tumoral in vivo usando [18 F]FMISO e [18F]FDG PET/MR. A incorporação de HAL faz um modelo adequado de xenoenxertos de camundongos com CHC transgênicos ou quimicamente induzidos para estudar a hipóxia tumoral in vivo, uma vez que a HAL pode efetivamente bloquear o suprimento sanguíneo arterial para induzir hipóxia intratumoral 7,8. Além disso, ao contrário da coloração imuno-histoquímica ex vivo com pimonidazol, as alterações no metabolismo tumoral como resultado da hipóxia podem ser prontamente visualizadas e quantificadas com precisão de forma não invasiva usando imagens PET, permitindo a avaliação longitudinal da resposta ao tratamento ou a aferição do surgimento de resistência 3,7,8 . Nosso método mostrado aqui permite a criação de um modelo robusto de CHC hipóxico juntamente com o monitoramento não invasivo da hipóxia tumoral usando imagens PET/MR para estudar a biologia do CHC in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, descrevemos os procedimentos para a realização de HAL em xenoenxertos ortotópicos hepáticos de CHC utilizando tumores subcutâneos, juntamente com métodos para o monitoramento não invasivo da hipóxia tumoral em xenoenxertos ortotópicos utilizando [18 F]FMISO e [18F]FDG PET/MR. Nosso interesse está na imagem metabólica de vários modelos de câncer e doença para diagnóstico precoce e avaliação da resposta ao tratamento11,13,14,15<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos o apoio do Fundo Fiduciário Anticâncer de Hong Kong, do Fundo de Pesquisa Colaborativa do Conselho de Bolsas de Pesquisa de Hong Kong (CRF C7018-14E) para os experimentos de imagem de pequenos animais. Também agradecemos o apoio do Molecular Imaging and Medical Cyclotron Center (MIMCC) da Universidade de Hong Kong pelo fornecimento de [18 F]FMISO e [18F]FDG.
Materials
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
References
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