Imagerie TEP/RM non invasive dans un modèle murin orthotopique de carcinome hépatocellulaire

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour créer des xénogreffes orthotopiques de carcinome hépatocellulaire avec et sans ligature de l’artère hépatique et effectuer une imagerie non invasive par tomographie par émission de positrons (TEP) de l’hypoxie tumorale en utilisant [18 F]Fluoromisonidazole ([18 F]FMISO) et [18 F]Fluorodésoxyglucose ([¹⁸F]FDG).

Abstract

Les modèles expérimentaux précliniques de carcinome hépatocellulaire (CHC) qui récapitulent la maladie humaine représentent un outil important pour étudier la tumorigenèse et évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. L’imagerie non invasive du corps entier utilisant la tomographie par émission de positrons (TEP) fournit des informations essentielles sur les caractéristiques in vivo des tissus au niveau moléculaire en temps réel. Nous présentons ici un protocole pour la création de xénogreffes orthotopiques du CHC avec et sans ligature de l’artère hépatique (HAL) pour induire l’hypoxie tumorale et l’évaluation de leur métabolisme tumoral in vivo en utilisant [18 F]Fluoromisonidazole ([18 F]FMISO) et [18 F]Fluorodésoxyglucose ([¹⁸F]FDG) TEP/résonance magnétique (RM). L’hypoxie tumorale pouvait être facilement visualisée à l’aide du marqueur d’hypoxie [18 F]FMISO, et il a été constaté que l’absorption de [18 F]FMISO était plus élevée chez les souris CHC ayant subi HAL que dans le groupe non-HAL, alors que [¹⁸F]FDG ne pouvait pas distinguer l’hypoxie tumorale entre les deux groupes. Les tumeurs HAL ont également montré un niveau plus élevé d’expression du facteur inductible par l’hypoxie (HIF)-1α en réponse à l’hypoxie. La quantification des tumeurs HAL a montré une augmentation de 2,3 fois de l’absorption de [¹⁸F]FMISO sur la base de l’approche d’absorption de la valeur standardisée (SUV).

Introduction

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le sixième cancer le plus diagnostiqué et la troisième cause de décès par cancer dans le monde, avec plus de 900 000 nouveaux cas et 800 000 décès en 2020¹. Le principal facteur de risque est la cirrhose, qui survient à la suite d’infections virales (virus de l’hépatite B et C), de l’abus d’alcool, du diabète et de la stéatohépatite² non alcoolique. La prise en charge du CHC est assez complexe et plusieurs options de traitement sont disponibles, notamment la résection chirurgicale, l’ablation thermique ou chimique, la transplantation, la chimioembolisation transartérielle, la radiothérapie et la chimiothérapie, selon la stadification de la maladie ^2,3. Le CHC est une tumeur réfractaire à la chimiothérapie avec récidive de la maladie chez jusqu’à 70% des patients suivant un traitement à visée curative².

Malgré le degré élevé d’hétérogénéité tumorale, le CHC est associé à deux résultats communs : (i) le CHC est très hypoxique, et (ii) l’hypoxie tumorale est liée à une plus grande agressivité tumorale et à l’échec du traitement. La prolifération incontrôlée des cellules CHC entraîne un taux de consommation d’oxygène élevé qui précède la vascularisation, créant ainsi un microenvironnement hypoxique. De faibles niveaux d’oxygène intra-tumoral déclenchent alors une gamme de réponses biologiques qui influencent l’agressivité tumorale et la réponse au traitement. Les facteurs inductibles par l’hypoxie (HIF) sont souvent reconnus comme les régulateurs transcriptionnels essentiels dans la réponse à l’hypoxie ^2,3. Par conséquent, la capacité de détecter l’hypoxie est cruciale pour visualiser les tissus néoplasiques et identifier les sites inaccessibles, qui nécessitent des procédures invasives. Il aide également à mieux comprendre les changements moléculaires qui conduisent à l’agressivité tumorale et à améliorer les résultats du traitement des patients.

L’imagerie moléculaire par tomographie par émission de positrons (TEP) est couramment utilisée dans le diagnostic et la stadification de nombreux cancers, y compris le CHC. En particulier, l’utilisation combinée de l’imagerie TEP à double traceur impliquant [18 F]Fluorodésoxyglucose ([¹⁸F]FDG) et [¹¹C]Acétate peut augmenter significativement la sensibilité globale dans le diagnostic du CHC ^4,5. L’imagerie de l’hypoxie, d’autre part, peut être réalisée en utilisant le marqueur hypoxique couramment utilisé [18 F]Fluoromisonidazole ([¹⁸F]FMISO). En pratique clinique, l’évaluation non invasive de l’hypoxie est importante pour différencier les différents types de tumeurs et de régions pour la planification de la radiothérapie⁶.

L’imagerie préclinique est devenue un outil indispensable pour l’évaluation non invasive et longitudinale de modèles murins pour différentes maladies. Un modèle de CHC robuste et hautement reproductible représente une plate-forme importante pour la recherche préclinique et translationnelle sur la physiopathologie du CHC humain et l’évaluation de nouvelles thérapies. Avec l’imagerie TEP, les comportements in vivo peuvent être élucidés pour fournir des informations importantes au niveau moléculaire pour un point temporel donné. Ici, nous décrivons un protocole pour la génération de xénogreffes orthotopiques du CHC ligature de l’artère hépatique (HAL) et l’analyse de leur métabolisme tumoral in vivo en utilisant [18 F]FMISO et [¹⁸F]FDG PET/MR. L’incorporation de HAL permet d’obtenir un modèle approprié de xénogreffes de souris CHC transgéniques ou induites chimiquement pour étudier l’hypoxie tumorale in vivo, car HAL peut bloquer efficacement l’apport sanguin artériel pour induire une hypoxie intra-tumorale ^7,8. En outre, contrairement à la coloration immunohistochimique ex vivo à l’aide de pimonidazole, les modifications du métabolisme tumoral résultant de l’hypoxie peuvent être facilement visualisées et quantifiées avec précision de manière non invasive à l’aide de l’imagerie TEP, ce qui permet une évaluation longitudinale de la réponse au traitement ou une mesure de l’émergence d’une résistance ^3,7,8 . Notre méthode présentée ici permet la création d’un modèle de CHC hypoxique robuste ainsi qu’une surveillance non invasive de l’hypoxie tumorale à l’aide de l’imagerie TEP/RM pour étudier la biologie du CHC in vivo.

Protocol

Toutes les études sur les animaux ont été réalisées conformément au Comité sur l’utilisation des animaux vivants dans l’enseignement et la recherche (CULATR) du Centre de recherche en médecine comparée (CCMR) de l’Université de Hong Kong, un programme accrédité par l’Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Les animaux utilisés dans l’étude étaient des souris femelles BALB / cAnN-nu (Nude) âgées de 6 à 8 semaines, pesant 20 g ± 2 g. La…

Representative Results

Pour obtenir un bloc tumoral approprié pour les implantations orthotopiques successives, des clones stables ont d’abord été générés par injection sous-cutanée de 200 μL de suspension cellulaire dans DPBS (contenant des cellules MHCC97L) dans le flanc inférieur de souris nues (Figure 1A). La croissance tumorale a été surveillée et, lorsque la taille de la tumeur a atteint 800-1000 mm 3 (environ 4 semaines après l’injection), les souris ont été euthanasiées et le bloc tumor…

Discussion

Dans cette étude, nous avons décrit les procédures pour effectuer HAL sur des xénogreffes de CHC orthotopiques hépatiques utilisant des tumeurs sous-cutanées, ainsi que des méthodes de surveillance non invasive de l’hypoxie tumorale dans les xénogreffes orthotopiques en utilisant [18 F]FMISO et [¹⁸F]FDG PET/MR. Nous nous intéressons à l’imagerie métabolique de divers modèles de cancer et de maladie pour le diagnostic précoce et l’évaluation de la réponse au traitement<sup class=…

Materials

0.9% sterile saline	BBraun	N/A	0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL
10# Scalpel blade	RWD Life Science Co.,ltd	S31010-01	Animal surgery tool
10% povidone-iodine solution	Banitore	6.425.678	For disinfection
25G needle with a 1 mL syringe	BD PrecisionGlide	N/A	1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections
5 mL syringe	Terumo	SS05L	5 mL syringe Luer Lock
70% Ethanol	Merck	1.07017	For disinfection
Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAF2000	For automated cell counting
Buprenorphine	HealthDirect	N/A	Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery
Cell Culture Dish (60 mm diameter)	Thermo Scientific	150462	For tumor tissue processing
Centrifuge	Sigma	3-16KL, fixed-angle rotor 12311	For cell suspensions collection
Centrifuge Conical Tube	Eppendorf	EP0030122151	For cell suspensions collection
Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)	Gibco	10566024	high glucose, GlutaMAX™ Supplement
Digital Caliper	RS PRO	841-2518	For subcutaneous tumor size measurement
Direct heat CO2 incubator	Techcomp Limited	NU5841	For cell culture
Dose calibrator	Biodex	N/A	Atomlab 500
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline)	Gibco	14287072	For cell wash and injection
Eye lubricant	Alcon Duratears	N/A	Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	A4766801	Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines
Forceps (curved fine and straight blunt)	RWD Life Science Co.,ltd	F12012-10 & F12011-13	Animal surgery tool
Heating pad	ALA Scientific Instruments	N/A	Heat pad for mice during surgery
Insulin syringe	Terumo	10ME2913	1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections
InterView fusion software	Mediso	Version 3.03	Post-processing and image analysis software
Inverted microscope	Yu Lung Scientific Co., Ltd	BM-209G	For cells morphology visualization
Isoflurane	Chanelle Pharma	N/A	Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL
Ketamine	Alfasan International B.V.	HK-37715	Ketamine 10% injection solution, 10 mL
Medical oxygen	Linde HKO	101-HR	compressed gas, 99.5% purity
nanoScan PET/MR Scanner	Mediso	N/A	3 Tesla MR
Needle holder	RWD Life Science Co.,ltd	F31026-12	Animal surgery tool
Nucline nanoScan software	Mediso	Version 3.0	Scanner operating software
Nylon Suture (6/0 and 5/0)	Healthy Medical Company Ltd	000524 & 000526	Animal surgery tool
Penicillin- Streptomycin	Gibco	15140122	Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin.
Pentabarbital	AlfaMedic	13003	Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice
Sharp scissors	RWD Life Science Co.,ltd	S14014-10	Animal surgery tool
Spring Scissors	RWD Life Science Co.,ltd	S11005-09	Animal surgery tool
Trypan Blue Solution, 0,4%	Gibco	15250061	For cell counting
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red.	Gibco	25200072	For cell digestion
Xylazine	Alfasan International B.V.	HK-56179	Xylazine 2% injection solution, 30 mL