הדמיית PET/MR לא פולשנית במודל עכבר אורתוטופי של קרצינומה הפטוצלולרית
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת קסנושתרים אורתוטופיים של קרצינומה הפטוצלולרית עם ובלי קשירת עורק הכבד ומבצעים הדמיית טומוגרפיה לא פולשנית של פליטת פוזיטרונים (PET) של היפוקסיה גידולית באמצעות [18 F]Fluoromisonidazole ([18 F]FMISO) ו- [18 F]Fluorodeoxyglucose ([18F]FDG).
Abstract
מודלים ניסיוניים פרה-קליניים של קרצינומה הפטוצלולרית (HCC) המחזירים מחלות אנושיות מייצגים כלי חשוב לחקר גידולים ולהערכת גישות טיפוליות חדשניות. הדמיה לא פולשנית של כל הגוף באמצעות טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) מספקת תובנות קריטיות לגבי מאפייני in vivo של רקמות ברמה המולקולרית בזמן אמת. אנו מציגים כאן פרוטוקול ליצירת קסנוגרפט HCC אורתוטופי עם וללא קשירת עורק כבד (HAL) כדי לגרום להיפוקסיה של הגידול והערכת חילוף החומרים של הגידול שלהם in vivo באמצעות [18 F]Fluoromisonidazole ([18 F]FMISO) ו- [18 F]Fluorodeoxyglucose ([18F]FDG) PET/הדמיית תהודה מגנטית (MR). ניתן היה לדמיין היפוקסיה של הגידול בקלות באמצעות סמן ההיפוקסיה [18 F]FMISO, ונמצא כי ספיגת [18 F]FMISO הייתה גבוהה יותר בעכברי HCC שעברו HAL מאשר בקבוצה שאינה HAL, בעוד [18F]FDG לא יכול היה להבחין בהיפוקסיה גידולית בין שתי הקבוצות. גידולי HAL הראו גם רמה גבוהה יותר של ביטוי גורם היפוקסיה (HIF)-1α בתגובה להיפוקסיה. כימות גידולי HAL הראה עלייה של פי 2.3 בספיגת [18F]FMISO בהתבסס על גישת ספיגת הערך המתוקנן (SUV).
Introduction
קרצינומה הפטוצלולרית (HCC) היא הסרטן השישי המאובחן ביותר וגורם המוות השלישי בשכיחותו מסרטן ברחבי העולם, עם יותר מ -900,000 מקרים חדשים ו -800,000 מקרי מוות בשנת 20201. גורם הסיכון העיקרי הוא שחמת הכבד, המתרחשת כתוצאה מזיהומים ויראליים (נגיפי הפטיטיס B ו- C), שימוש לרעה באלכוהול, סוכרת וסטאטוהפטיטיס2 שאינו אלכוהולי. הניהול של HCC הוא מורכב למדי, ומספר אפשרויות טיפול זמינות, כולל כריתה כירורגית, אבלציה תרמית או כימית, השתלה, כימואמבוליזציה transarterial, הקרנות, וכימותרפיה, בהתאם למחלה היערכות 2,3. HCC הוא גידול עמיד לכימותרפיה עם הישנות המחלה בעד 70% מהחולים לאחר טיפול בכוונת ריפוי2.
למרות הרמה הגבוהה של הטרוגניות הגידול, HCC קשור לשתי תוצאות נפוצות: (i) HCC הוא היפוקסי מאוד, ו (ii) היפוקסיה הגידול קשורה לאגרסיביות גדולה יותר של הגידול וכישלון הטיפול. התרבות בלתי מבוקרת של תאי HCC גורמת לקצב צריכת חמצן גבוה שקודם לכלי הדם, ובכך יוצרת מיקרו-סביבה היפוקסית. רמות חמצן תוך-גידוליות נמוכות מעוררות מגוון תגובות ביולוגיות המשפיעות על תוקפנות הגידול ועל תגובת הטיפול. גורמים המושרים להיפוקסיה (HIFs) מוכרים לעתים קרובות כווסתי התמלול החיוניים בתגובה להיפוקסיה 2,3. לפיכך, היכולת לזהות היפוקסיה היא חיונית כדי לדמיין רקמות ניאופלסטיות ולזהות את האתרים הבלתי נגישים, אשר דורשים הליכים פולשניים. זה גם עוזר להבין טוב יותר את השינויים המולקולריים שמובילים לאגרסיביות הגידול ולשפר את תוצאות הטיפול בחולה.
הדמיה מולקולרית באמצעות טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) משמשת בדרך כלל באבחון ובימוי של סוגי סרטן רבים, כולל HCC. בפרט, השימוש המשולב של הדמיית PET נותב כפול המערב [18 F]Fluorodeoxyglucose ([18F]FDG) ו [11C]אצטט יכול להגדיל באופן משמעותי את הרגישות הכוללת באבחון HCC 4,5. הדמיה של היפוקסיה, לעומת זאת, יכולה להיות מושגת באמצעות סמן היפוקסי נפוץ [18 F]Fluoromisonidazole ([18F]FMISO). בפרקטיקה הקלינית, הערכה לא פולשנית של היפוקסיה חשובה כדי להבדיל בין סוגים שונים של גידולים ואזורים לתכנון טיפול קרינתי6.
הדמיה פרה-קלינית הפכה לכלי חיוני להערכה לא פולשנית ואורכית של מודלים עכבריים למחלות שונות. מודל HCC חזק וניתן לשחזור מייצג פלטפורמה חשובה למחקר פרה-קליני ותרגומי לפתופיזיולוגיה של HCC אנושי ולהערכת טיפולים חדשניים. יחד עם הדמיית PET, ניתן להבהיר התנהגויות in vivo כדי לספק תובנות חשובות ברמה המולקולרית עבור כל נקודת זמן נתונה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת קסנוגרפטים אורתוטופיים של HCC קשירת עורק כבד (HAL) וניתוח חילוף החומרים של גידולי in vivo שלהם באמצעות [18 F]FMISO ו- [18F]FDG PET/MR. השילוב של HAL יוצר מודל מתאים של עכברי HCC טרנסגניים או כימיים כדי לחקור היפוקסיה גידולית in vivo, שכן HAL יכול לחסום ביעילות את אספקת הדם העורקית כדי לגרום להיפוקסיה תוך גידולית 7,8. בנוסף, שלא כמו צביעה אימונוהיסטוכימית ex vivo באמצעות pimonidazole, שינויים בחילוף החומרים של הגידול כתוצאה מהיפוקסיה ניתנים להדמיה קלה ולכימות מדויק באופן לא פולשני באמצעות הדמיית PET, המאפשרת הערכה אורכית של תגובת הטיפול או מדידת הופעת עמידות 3,7,8 . השיטה שלנו המוצגת כאן מאפשרת יצירת מודל HCC היפוקסי חזק יחד עם ניטור לא פולשני של היפוקסיה גידולית באמצעות הדמיית PET/MR לחקר ביולוגיה של HCC in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, תיארנו את ההליכים לביצוע HAL על HCC xenografts אורתוטופי בכבד באמצעות גידולים תת עוריים, יחד עם שיטות לניטור לא פולשני של היפוקסיה גידולית ב xenografts אורתוטופיים באמצעות [18 F]FMISO ו [18F]FDG PET/MR. העניין שלנו הוא הדמיה מטבולית של מודלים שונים של סרטן ומחלות לאבחון מוקדם והערכת תגובה לטי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים על תמיכתה של קרן הנאמנות נגד סרטן של הונג קונג, קרן המחקר השיתופית של מועצת מענקי המחקר של הונג קונג (CRF C7018-14E) לניסויי הדמיה בבעלי חיים קטנים. אנו מודים גם לתמיכת המרכז לדימות מולקולרי וציקלוטרון רפואי (MIMCC) באוניברסיטת הונג קונג על אספקת [18 F]FMISO ו- [18F]FDG.
Materials
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Chen, C., Lou, T. Hypoxia inducible factors in hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 8 (28), 46691-46703 (2017).
- Lu, R. -. C., et al. Positron-emission tomography for hepatocellular carcinoma: Current status and future prospects. World Journal of Gastroenterology. 25 (32), 4682-4695 (2019).
- Larsson, P., et al. Adding 11C-acetate to 18F-FDG at PET examination has an incremental value in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Molecular Imaging and Radionuclide Therapy. 21 (1), 6-12 (2012).
- Huo, L., et al. Kinetic analysis of dynamic 11C-acetate PET/CT imaging as a potential method for differentiation of hepatocellular carcinoma and benign liver lesions. Theranostics. 5 (4), 371-377 (2015).
- Lopci, E., et al. PET radiopharmaceuticals for imaging of tumor hypoxia: A review of the evidence. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 4 (4), 365-384 (2014).
- Mao, X., et al. Mechanisms through which hypoxia-induced caveolin-1 drives tumorigenesis and metastasis in hepatocellular carcinoma. Cancer Research. 76 (24), 7242-7253 (2016).
- Kung-Chun Chiu, D., et al. Hypoxia regulates the mitochondrial activity of hepatocellular carcinoma cells through HIF/HEY1/PINK1 pathway. Cell Death & Disease. 10 (12), 934 (2019).
- Li, Y., et al. Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97. World Journal of Gastroenterology. 7 (5), 630-636 (2001).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42 (6), 217-224 (2013).
- Liu, Q., Tan, K. V., Chang, H. C., Khong, P. L., Hui, X. Visualization and quantification of brown and beige adipose tissues in mice using [18F] FDG micro-PET/MR imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (173), e62460 (2021).
- Lin, W. -. H., et al. Hypoxia-activated cytotoxic agent tirapazamine enhances hepatic artery ligation-induced killing of liver tumor in HBx transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11937-11942 (2016).
- Wong, T. L., et al. CRAF methylation by PRMT6 regulates aerobic glycolysis-driven hepatocarcinogenesis via ERK-dependent PKM2 nuclear relocalization and activation. Hepatology. 71 (4), 1279-1296 (2020).
- Yang, X., et al. Development of cisplatin-loaded hydrogels for trans-portal vein chemoembolization in an orthotopic liver cancer mouse model. Drug Delivery. 28 (1), 520-529 (2021).
- Shi, J., et al. Longitudinal evaluation of five nasopharyngeal carcinoma animal models on the microPET/MR platform. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (5), 1497-1507 (2021).
- Kilian, K., et al. Imaging of hypoxia in small animals with F fluoromisonidasole. Nukleonika. 61 (2), 219-223 (2016).
- Kawamura, M., et al. Evaluation of optimal post-injection timing of hypoxic imaging with 18F-Fluoromisonidazole-PET/CT. Molecular Imaging and Biology. 23 (4), 597-603 (2021).
