Summary

Nicht-invasive PET/MR-Bildgebung in einem orthotopen Mausmodell des hepatozellulären Karzinoms

Published: August 31, 2022
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Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erstellung orthotoper hepatozellulärer Karzinom-Xenotransplantate mit und ohne Leberarterienligatur vor und führen eine nicht-invasive Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Bildgebung der Tumorhypoxie unter Verwendung von [18 F]Fluoromisonidazol ([18 F]FMISO) und [18 F]Fluordesoxyglucose ([18F]FDG) durch.

Abstract

Präklinische experimentelle Modelle des hepatozellulären Karzinoms (HCC), die menschliche Erkrankungen rekapitulieren, stellen ein wichtiges Werkzeug dar, um die Tumorgenese zu untersuchen und neue Therapieansätze zu evaluieren. Die nicht-invasive Ganzkörperbildgebung mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) liefert in Echtzeit entscheidende Einblicke in die In-vivo-Eigenschaften von Geweben auf molekularer Ebene. Wir präsentieren hier ein Protokoll für die orthotope HCC-Xenotransplantat-Erstellung mit und ohne hepatische Arterienligatur (HAL) zur Induktion von Tumorhypoxie und die Beurteilung ihres Tumorstoffwechsels in vivo unter Verwendung von [18 F]Fluoromisonidazol ([18 F]FMISO) und [18 F]Fluordesoxyglucose ([18F]FDG) PET/Magnetresonanz (MR) Bildgebung. Die Tumorhypoxie konnte mit dem Hypoxiemarker [18 F]FMISO leicht sichtbar gemacht werden, und es wurde festgestellt, dass die [18 F]FMISO-Aufnahme bei HCC-Mäusen, die HAL unterzogen wurden, höher war als in der Nicht-HAL-Gruppe, während [18F]FDG die Tumorhypoxie zwischen den beiden Gruppen nicht unterscheiden konnte. HAL-Tumoren zeigten auch eine höhere Expression des Hypoxie-induzierbaren Faktors (HIF)-1α als Reaktion auf Hypoxie. Die Quantifizierung von HAL-Tumoren zeigte einen 2,3-fachen Anstieg der [18F]FMISO-Aufnahme basierend auf dem Ansatz der standardisierten Wertaufnahme (SUV).

Introduction

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist mit mehr als 900.000 neuen Fällen und 800.000 Todesfällen im Jahr 2020 die sechsthäufigste Krebserkrankung und die dritthäufigste Todesursache durch Krebs weltweit1. Der Hauptrisikofaktor ist die Leberzirrhose, die als Folge von Virusinfektionen (Hepatitis B- und C-Viren), Alkoholmissbrauch, Diabetes und nichtalkoholischer Steatohepatitis2 auftritt. Die Behandlung von HCC ist ziemlich komplex, und es stehen verschiedene Behandlungsoptionen zur Verfügung, darunter chirurgische Resektion, thermische oder chemische Ablation, Transplantation, transarterielle Chemoembolisation, Bestrahlung und Chemotherapie, abhängig vom Krankheitsstadium 2,3. HCC ist ein Chemotherapie-refraktärer Tumor mit einem Wiederauftreten der Erkrankung bei bis zu 70% der Patienten nach kurativer Therapie2.

Trotz des hohen Grades an Tumorheterogenität ist HCC mit zwei gemeinsamen Endpunkten assoziiert: (i) HCC ist sehr hypoxisch und (ii) Tumorhypoxie ist mit größerer Tumoraggressivität und Behandlungsversagen verbunden. Die unkontrollierte Proliferation von HCC-Zellen führt zu einer hohen Sauerstoffverbrauchsrate, die der Vaskularisierung vorausgeht, wodurch eine hypoxische Mikroumgebung entsteht. Niedrige intratumorale Sauerstoffwerte lösen dann eine Reihe von biologischen Reaktionen aus, die die Aggressivität des Tumors und das Ansprechen auf die Behandlung beeinflussen. Hypoxie-induzierbare Faktoren (HIFs) werden oft als die wesentlichen Transkriptionsregulatoren bei der Reaktion auf Hypoxieanerkannt 2,3. Daher ist die Fähigkeit, Hypoxie zu erkennen, von entscheidender Bedeutung, um neoplastisches Gewebe sichtbar zu machen und die unzugänglichen Stellen zu identifizieren, die invasive Verfahren erfordern. Es hilft auch, die molekularen Veränderungen, die zur Aggressivität des Tumors führen, besser zu verstehen und die Behandlungsergebnisse der Patienten zu verbessern.

Die molekulare Bildgebung mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) wird häufig bei der Diagnose und Stadieneinteilung vieler Krebsarten, einschließlich HCC, eingesetzt. Insbesondere die kombinierte Verwendung von Dual-Tracer-PET-Bildgebung mit [18 F]Fluordesoxyglucose ([18F]FDG) und [11C]Acetat kann die Gesamtsensitivität bei der HCC-Diagnose signifikant erhöhen 4,5. Die Bildgebung der Hypoxie kann hingegen durch die Verwendung des häufig verwendeten hypoxischen Markers [18 F]Fluoromisonidazol ([18F]FMISO) erreicht werden. In der klinischen Praxis ist die nicht-invasive Beurteilung der Hypoxie wichtig, um zwischen verschiedenen Tumorarten und Regionen für die Strahlentherapieplanung zu unterscheiden6.

Die präklinische Bildgebung ist zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die nicht-invasive und longitudinale Evaluierung von Mausmodellen für verschiedene Krankheiten geworden. Ein robustes und hochreproduzierbares HCC-Modell stellt eine wichtige Plattform für die präklinische und translationale Forschung zur Pathophysiologie des humanen HCC und zur Bewertung neuartiger Therapien dar. Zusammen mit der PET-Bildgebung können In-vivo-Verhaltensweisen aufgeklärt werden, um wichtige Erkenntnisse auf molekularer Ebene für einen bestimmten Zeitpunkt zu gewinnen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Erzeugung von orthotopen HCC-Xenotransplantaten der Leberarterienligatur (HAL) und die Analyse ihres in vivo Tumormetabolismus unter Verwendung von [18 F]FMISO und [18F]FDG PET/MR. Der Einbau von HAL ist ein geeignetes Modell für transgene oder chemisch induzierte HCC-Mäuse-Xenotransplantate, um Tumorhypoxie in vivo zu untersuchen, da HAL die arterielle Blutversorgung effektiv blockieren kann, um intratumorale Hypoxie zu induzieren 7,8. Darüber hinaus können Veränderungen des Tumorstoffwechsels infolge von Hypoxie im Gegensatz zur immunhistochemischen Ex-vivo-Färbung mit Pimonidazol nicht-invasiv mittels PET-Bildgebung leicht visualisiert und genau quantifiziert werden, was eine longitudinale Beurteilung des Therapieansprechens oder eine Messung des Auftretens von Resistenzen ermöglicht 3,7,8 . Unsere hier gezeigte Methode ermöglicht die Erstellung eines robusten hypoxischen HCC-Modells zusammen mit der nicht-invasiven Überwachung der Tumorhypoxie mittels PET/MR-Bildgebung, um die HCC-Biologie in vivo zu untersuchen.

Protocol

Alle Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit dem Ausschuss für die Verwendung lebender Tiere in Lehre und Forschung (CULATR) im Zentrum für vergleichende medizinische Forschung (CCMR) an der Universität von Hongkong durchgeführt, einem Programm, das von der Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) akkreditiert ist. Bei den in der Studie verwendeten Tieren handelte es sich um weibliche BALB/cAnN-nu (Nacktmäuse) im Alter von 6-8 Wochen mit einem Gewicht von 2…

Representative Results

Um einen geeigneten Tumorblock für die sukzessive orthotope Implantation zu erhalten, wurden zunächst stabile Klone durch subkutane Injektion von 200 μl Zellsuspension in DPBS (mit MHCC97L-Zellen) in die untere Flanke von Nacktmäusen erzeugt (Abbildung 1A). Das Tumorwachstum wurde überwacht, und als die Tumorgröße 800-1000 mm 3 erreichte (etwa 4 Wochen nach der Injektion), wurden die Mäuse eingeschläfert, und der resultierende Tumorblock wurde in etwa 1 mm3 Fra…

Discussion

In dieser Studie beschrieben wir die Verfahren zur Durchführung von HAL an orthotopen HCC-Xenotransplantaten in der Leber unter Verwendung subkutaner Tumoren sowie Methoden zur nicht-invasiven Überwachung der Tumorhypoxie bei orthotopen Xenotransplantaten unter Verwendung von [18 F]FMISO und [18F]FDG PET/MR. Unser Interesse gilt der metabolischen Bildgebung verschiedener Krebs- und Krankheitsmodelle zur Früherkennung und Bewertung des Therapieansprechens11,13,14,15</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir bedanken uns für die Unterstützung des Hong Kong Anticancer Trust Fund, Hong Kong Research Grants Council Collaborative Research Fund (CRF C7018-14E) für die Bildgebungsexperimente bei Kleintieren. Wir danken auch für die Unterstützung des Molecular Imaging and Medical Cyclotron Center (MIMCC) an der University of Hong Kong für die Bereitstellung von [18 F]FMISO und [18F]FDG.

Materials

0.9% sterile saline BBraun N/A 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL
10# Scalpel blade RWD Life Science Co.,ltd S31010-01 Animal surgery tool
10% povidone-iodine solution Banitore 6.425.678 For disinfection
25G needle with a 1 mL syringe BD PrecisionGlide N/A 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections
5 mL syringe Terumo SS05L 5 mL syringe Luer Lock
70% Ethanol Merck 1.07017 For disinfection
Automated Cell Counter Invitrogen AMQAF2000 For automated cell counting
Buprenorphine HealthDirect N/A Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery
Cell Culture Dish (60 mm diameter) Thermo Scientific 150462 For tumor tissue processing
Centrifuge Sigma 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 For cell suspensions collection
Centrifuge Conical Tube Eppendorf EP0030122151 For cell suspensions collection
Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) Gibco 10566024 high glucose, GlutaMAX™ Supplement
Digital Caliper RS PRO 841-2518 For subcutaneous tumor size measurement
Direct heat CO2 incubator Techcomp Limited NU5841 For cell culture
Dose calibrator Biodex  N/A Atomlab 500
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) Gibco 14287072 For cell wash and injection
Eye lubricant Alcon Duratears  N/A Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g
Fetal bovine serum (FBS) Gibco A4766801 Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines
Forceps (curved fine and straight blunt) RWD Life Science Co.,ltd F12012-10 & F12011-13 Animal surgery tool
Heating pad ALA Scientific Instruments N/A Heat pad for mice during surgery
Insulin syringe Terumo 10ME2913 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections
InterView fusion software Mediso Version 3.03 Post-processing and image analysis software
Inverted microscope Yu Lung Scientific Co., Ltd BM-209G For cells morphology visualization
Isoflurane Chanelle Pharma  N/A Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL
Ketamine Alfasan International B.V. HK-37715 Ketamine 10% injection solution, 10 mL 
Medical oxygen Linde HKO 101-HR compressed gas, 99.5% purity
nanoScan PET/MR Scanner Mediso  N/A 3 Tesla MR
Needle holder RWD Life Science Co.,ltd F31026-12 Animal surgery tool
Nucline nanoScan software Mediso Version 3.0 Scanner operating software
Nylon Suture (6/0 and 5/0) Healthy Medical Company Ltd 000524 & 000526 Animal surgery tool
Penicillin- Streptomycin Gibco 15140122 Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin.
Pentabarbital AlfaMedic 13003 Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice
Sharp scissors RWD Life Science Co.,ltd S14014-10 Animal surgery tool
Spring Scissors RWD Life Science Co.,ltd S11005-09 Animal surgery tool
Trypan Blue Solution, 0,4% Gibco 15250061 For cell counting
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. Gibco 25200072 For cell digestion
Xylazine Alfasan International B.V. HK-56179 Xylazine 2% injection solution, 30 mL

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Cite This Article
Tan, K. V., Yang, X., Chan, C. Y., Shi, J., Chang, H., Chiu, K. W., Man, K. Non-Invasive PET/MR Imaging in an Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma. J. Vis. Exp. (186), e63958, doi:10.3791/63958 (2022).

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