Summary

Sıçan Astrositleri ve Mikroglia'nın Birincil Kültürleri ve Amiyotrofik Lateral Skleroz Çalışmalarında Kullanımları

Published: June 23, 2022
doi:

Summary

Burada, hSOD1G93A sıçan modelinde amiyotrofik lateral sklerozun patofizyolojisi üzerine araştırmalar için hücre içi Ca2+‘nın hızlandırılmış video görüntülemesi için sıçan kortekslerinden glial hücrelerin, astrositlerin ve mikrogliaların primer kültürlerinin nasıl hazırlanacağına dair bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Bu protokol, Sprague Dawley sıçanlarının kortekslerinden glial hücrelerin, astrositlerin ve mikrogliaların birincil kültürlerinin nasıl hazırlanacağını ve bu hücrelerin sıçan hSOD1G93A modelinde amiyotrofik lateral skleroz (ALS) patofizyolojisini incelemek amacıyla nasıl kullanılacağını göstermektedir. İlk olarak, protokol astrositlerin ve mikrogliaların doğum sonrası sıçan kortekslerinden nasıl izole edileceğini ve kültürleneceğini ve daha sonra astrositlerin glial fibriler asidik protein (GFAP) belirtecini ve iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 1 (Iba1) mikroglial belirtecini kullanarak immünositokimya ile bu kültürlerin saflık için nasıl karakterize edileceğini ve test edileceğini göstermektedir. Bir sonraki aşamada, kültürlenmiş hücrelerin boya yüklemesi (kalsiyuma duyarlı Fluo 4-) ve canlı hücreler üzerindeki video görüntüleme deneylerinde Ca2+ değişikliklerinin kayıtları için yöntemler açıklanmaktadır.

Video kayıtlarının örnekleri şunlardan oluşur: (1) ALS hastalarından izole edilen immünoglobulin G’ye (IgG) akut olarak maruz kalan kültürlü astrositlerin Ca2+ görüntüleme vakaları, aynı deneyde gösterildiği gibi ATP’ye verilen cevaba kıyasla karakteristik ve spesifik bir yanıt göstermektedir. Örnekler ayrıca, hSOD1G93A astrositlerinde ALS IgG tarafından uyarılan hücre içi kalsiyum konsantrasyonunda, transgenik olmayan kontrollere kıyasla daha belirgin bir geçici artış göstermektedir; (2) Endoplazmik retikulum Ca 2+ ATPaz’ın rekabetçi olmayan bir inhibitörü olan thapsigargin (Thg) tarafından kalsiyum depolarının tükenmesi sırasında kültürlenmiş astrositlerin Ca 2+ görüntülenmesi, ardından kayıt çözeltisine kalsiyum ilavesiyle ortaya çıkan depo tarafından işletilen kalsiyum girişi, hSOD1G93A’da ve transgenik olmayan astrositlerde Ca 2+ depo çalışması arasındaki farkı gösterir; (3) Kültürlü mikroglianın Ca 2+ görüntülemesi ağırlıklı olarak ALS IgG’ye yanıt eksikliği gösterirken, ATP uygulaması Ca2+ değişikliğine neden olmuştur. Bu makale aynı zamanda kritik hücre yoğunluğu ve kültürlerin saflığı ile ilgili olası uyarıları ve uyarıları vurgulamakta, Ca2+ boya ve boya yükleme tekniklerinin doğru konsantrasyonunu seçmektedir.

Introduction

Hücre kültürü teknikleri, sağlık ve hastalıkta hücresel nörofizyolojinin çeşitli alanlarında sayısız ilerlemeye yol açmıştır. Özellikle, bir laboratuar hayvanının nöronal dokusundan yeni izole edilmiş birincil hücre kültürleri, deneycinin farklı biyokimyasal ortamlardaki ve fizyolojik kurulumlardaki çeşitli hücrelerin davranışlarını yakından incelemesine izin verir. Hızlandırılmış video mikroskobu ile birlikte Ca2 + duyarlı boyalar gibi farklı floresan fizyolojik göstergelerin kullanılması, hücresel biyofiziksel ve biyokimyasal süreçler hakkında gerçek zamanlı olarak daha iyi bir fikir verir.

ALS, üst ve alt motor nöronları etkileyen yıkıcı bir nörodejeneratif hastalıktır1. Hastalık ailesel tipte kompleks bir patogeneze sahiptir, ancak çoğunlukla sporadik formdadır (vakaların %90’ı)2. Hücre dışı otonom mekanizmaların, öncelikle glial hücrelerin temel rolü nedeniyle ALS patofizyolojisine katkıda bulunduğu iyi bilinmektedir3. ALS ayrıca inflamasyonun humoral ve hücresel faktörlerinin tutulumu olan nöroinflamatuar bir hastalık olarak da karakterizedir.

İmmünoglobulin G, ALS ve diğer nörodejeneratif hastalıklarda moleküler bir belirteç olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu belirtecin serum seviyesinin incelenmesi, hastalıkta nöroinflamasyonun varlığını ve evresinigösterebilir 4,5,6, beyin omurilik sıvısındaki varlığı ise kan beyin bariyerinin ihlalini gösterebilir 7. IgG’ler ayrıca ALS hastalarının omurilik motor nöronlarında birikintiler olarak tanımlandı7. Bununla birlikte, bu yaklaşım IgG düzeyinin hastalığın evresi ve özellikleri ile korelasyonunda bazı tutarsızlıklar göstermiştir6.

ALS hastalarının serumlarından izole edilen IgG (ALS IgG), naif astrositlerde8 ve nöronlarda glutamat salınımında kalsiyum yanıtı indükleyebilir ve bu da ALS patolojisi9’un bir işareti olan eksitotoksik bir etkiye işaret eder. Bununla birlikte, hSOD1G93A ALS sıçan modeli üzerine yapılan çalışmalar (insan SOD1 mutasyonu10’un birden fazla kopyasını içeren), kültürlenmiş nöroglial hücrelerde11, dokularda 12,13,14 veya canlı hayvanlarda oksidatif stresin bir dizi belirtecini göstermiştir 13. ALS sıçan modelinden kültürlenen astrositlerin, peroksit tarafından indüklenen oksidatif strese, transgenik olmayan çöp arkadaşlarından gelen astrogliadan daha yatkın olmaları dikkat çekicidir11.

Kültürdeki mikroglial hücreler ALS IgG’den daha az belirgin bir şekilde etkilenir. Yani, bir BV-2 mikroglial hücre hattı, sadece 4/11 ALS IgG hasta örneklerinin uygulanmasına yanıt olarak oksidatif stresin floresan belirteçlerinden gelen sinyalde bir artış gösterdi15. Mikroglia’nın birçok nöroinflamatuar patolojiye katıldığı, ALS16,17’nin hücre dışı otonom mekanizmasında oksidatif strese ve geç progresyon fazına katkıda bulunduğu iyi bilinmektedir. Bununla birlikte, ALS IgGs ile ilgili veriler, bu hücrelerin ALS iltihabının bu humoral faktörlerine astrositler kadar reaktif olmayabileceğini göstermiştir. ALS murin modellerinden primer astrositlerle, sadece yavrularda değil, aynı zamanda semptomatik hayvanlarda, beyinde veya omurilikte 18,19,20,21 üzerinde çeşitli çalışmalar yapılmıştır. Bu aynı zamanda mikroglial primer kültürler için de geçerlidir, ancak astrositlerden daha az ölçüde ve çoğunlukla embriyonik aşamadaki beyin bölgelerinden22,23,24.

Kültürdeki hücreler üzerinde Ca2 + ‘nın hızlandırılmış video görüntülemesini, öncelikle eksitotoksisitenin fizyolojik bir belirteci olarak bu iyonun hücre içi geçicilerini takip etmenin bir aracı olarak kullanıyoruz. Böylece, bu geçicilerin biyofiziksel karakterizasyonu ile (genlik, geçici altındaki alan, yükselme zamanı, frekans) araştırmacı, nörodejenerasyonun çeşitli hücresel modellerinden deneysel tanı parametreleri elde edebilir. Bu nedenle bu teknik, IgG’lerin hastalık biyobelirteçleri olarak kantitatif fizyolojik değerlendirmesinin bir avantajını sunar. ALS indüksiyonunda IgGs ve Ca2+‘nın rolü hakkında geniş bir literatür bulunmaktadır. Bu çalışmaların çoğu, hasta IgG’leri deney hayvanlarına 25,26,27,28,29 enjekte ederek ALS’yi indükleyerek gerçekleştirildi ve daha sonra hücre içi Ca 2+ yükselmesi ve IgG birikintileri görüldü. Bir dizi çalışma, ALS IgG’lerin in vitro30,31,32 motor sinaps üzerindeki etkisini araştırdı. Yukarıdaki bağlamda, burada sunulan teknik, ALS’nin hücre dışı otonom mekanizmasında önemli oyuncular olarak glial hücrelere odaklanmakta ve nöroinflamasyonun humoral faktörleri olarak IgG’lere potansiyel eksitotoksik yanıtlarını ölçmektedir. Bu yaklaşım, farklı hücre kültürü sistemlerinde ve genel inflamasyonun hücresel modellerinde bütün serumlar, BOS veya sitokinler gibi diğer humoral faktörlerin test edilmesinde daha geniş bir uygulamaya sahip olabilir.

Bu yazıda, Sprague Dawley sıçanlarının kortekslerinden glial hücrelerin, astrositlerin ve mikrogliaların birincil kültürlerinin nasıl hazırlanacağı ve bu hücrelerin hasta sera kaynaklı IgG ile ALS patofizyolojisini incelemek için nasıl daha fazla kullanılacağı açıklanmaktadır. Protokoller, kültürlenmiş hücrelerin boya yüklenmesi (Şekil 1) ve hızlandırılmış video görüntüleme deneylerinde Ca2+ değişikliklerinin kayıtları için detaylandırılmıştır. Video kayıtlarının örnekleri, glial hücrelerin ALS IgG’ye ATP’ye kıyasla nasıl tepki verdiğini gösterecektir, ikincisi pürinerjik membran reseptörlerini aktive eder. İlk kez gösterilen, hSOD1G93A ALS sıçan beyninden izole edilen astrositlerin, transgenik olmayan kontrollere kıyasla ALS IgG’ye daha belirgin bir Ca2+ yanıtı ile nasıl tepki verdiğine ve bu sürecin Ca2 + depo operasyonundaki farklılıklarla nasıl ilişkilendirileceğine dair bir örnektir. Ayrıca, ALS IgG ile akut olarak meydan okuyan mikroglial hücrelerde, hücre içi kalsiyumun sadece mütevazı bir cevabı ile kalsiyum görüntülemenin bir örneği gösterilmiştir.

Protocol

Tüm deneyler, hayvanların bilimsel amaçlarla korunmasına ilişkin AB direktiflerine uygun olarak ve Belgrad Üniversitesi Biyoloji Fakültesi Etik Komisyonu’nun izniyle (onay numarası EK-BF-2016/08) gerçekleştirilmiştir. Hasta materyali (IgG’ler için serum) ile ilgili olarak, insanları içeren deneyler için Dünya Tabipler Birliği Etik Kurallarına (Helsinki Deklarasyonu) uygun olarak bilgilendirilmiş hastanın rızası ile rutin klinik muayene için toplanmıştır. Protokol, Sırbistan Klinik Merkezi Etik …

Representative Results

Kültürde farklı glial hücre tiplerinin karakterizasyonuDeneyler için astrositlerin üretilmesi genellikle 15-21 gün sürerken, mikroglial hücrelerin büyümesi 10-15 gün sürer. Kültürün hücre saflığını değerlendirmek için immün boyama yapıldı. Şekil 1 , astrositik işaretleyici GFAP ve mikroglial işaretleyici Iba1’in ilgili kültürlerdeki çift etiketleme ekspresyonunu göstermektedir. Kalsiyum görüntülemenin sağl?…

Discussion

Bu yazıda, sıçan hSOD1G93A modelinde ALS gibi hücre (pato) fizyolojisinin farklı yönlerini incelemek için hızlı ve “bütçeye uygun” bir araç olarak birincil hücre kültürleme yöntemi sunulmaktadır. Bu nedenle teknik, daha yüksek bir organizasyon seviyesinde (yani, doku dilimlerinde veya canlı bir hayvanda) ekstrapolasyon yapılabilen ve daha fazla araştırılabilen tek hücre seviyesindeki çalışmalar için uygundur. Bununla birlikte, bir teknik olarak hücre kültürlemenin birkaç uyarıs…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Sırbistan Eğitim Bilim ve Teknolojik Kalkınma Bakanlığı Sözleşmesi No. 451-03-9/2021-14/ 200178, MDBF – NENS Eğitim ve Öğretim Kümesi projesi “Nöroinflamasyonda Glia Üzerine Üçlü Kurs” ve EC H2020 MSCA RISE hibe #778405 tarafından desteklenmiştir. İmmünohistokimya görüntülerini sağladıkları için Marija Adžić ve Mina Perić’e ve kağıt yazımında yardımcı oldukları için Danijela Bataveljić’e teşekkür ederiz.

Materials

15 mL tube Sarstedt, Germany 62 554 502
2 mL tube Sarstedt, Germany 72.691
21 G needle Nipro, Japan HN-2138-ET
23 G needle Nipro, Japan HN-2338-ET
5 mL syringe Nipro, Japan SY3-5SC-EC
6 mm circular glass coverslip Menzel Glasser, Germany 630-2113
60 mm Petri dish ThermoFisher Sientific, USA 130181
ATP Sigma-Aldrich, Germany A9062
AxioObserver A1 Carl Zeiss, Germany
Bovine serum albumine Sigma-Aldrich, Germany B6917
Calcium chloride Sigma-Aldrich, Germany 2110
Centrifuge Eppendorf, Germany
DAPI Sigma-Aldrich, Germany 10236276001
D-glucose Sigma-Aldrich, Germany 158968
DMEM Sigma-Aldrich, Germany D5648
Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody Invitrogen, USA A-21447
Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody Invitrogen, USA A-21202
EDTA Sigma-Aldrich, Germany EDS-100G
EGTA Sigma-Aldrich, Germany E4378
”evolve”-EM 512 Digital Camera System Photometrics, USA
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, ThermoFisher Scientific, USA 10500064
Fiji ImageJ Software Open source under the GNU General Public Licence
FITC filter set Chroma Technology Inc., USA
Fluo-4 AM Molecular Probes, USA F14201
Goat anti-Iba1 Fujifilm Wako Chemicals, USA 011-27991
HEPES Biowest, France P5455
HighSpeed Solution Exchange System ALA Scientific Instruments, USA
Incubator Memmert GmbH + Co. KG, Germany
Magnesium chloride Sigma-Aldrich, Germany M2393
Matlab software Math Works, USA
Mouse anti-GFAP Merck Millipore, USA MAB360
Mowiol 40-88 Sigma-Aldrich, Germany 324590
Normal donkey serum Sigma-Aldrich, Germany D9663
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich, Germany 158127
Penicilin and Streptomycin ThermoFisher Sientific, USA 15140122
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich, Germany P5899
Potassium chloride Sigma-Aldrich, Germany P5405
Potassium dihydrogen phosphate Carlo Erba Reagents, Spain 471686
Shaker DELFIA PlateShake PerkinElmer Life Sciencies, USA
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, Germany S3817
Sodium chloride Sigma-Aldrich, Germany S5886
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Carl ROTH GmbH X987.2
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich, Germany P5280
Thapsigargine Tocris Bioscience, UK 1138
Triton X – 100 Sigma-Aldrich, Germany T8787
Trypsin Sigma-Aldrich, Germany T4799
Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520 Wescor, ELITechGroup Inc., USA
ViiFluor Imaging System Visitron System Gmbh, Germany
VisiChrome Polychromator System Visitron System Gmbh, Germany
VisiView high performance setup Visitron System Gmbh, Germany
Xenon Short Arc lamp Ushio, Japan

References

  1. Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
  2. Taylor, J. P., Brown, R. H. J., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
  3. Gleichman, A. J., Carmichael, S. T. Glia in neurodegeneration: Drivers of disease or along for the ride. Neurobiology of Disease. 142, 104957 (2022).
  4. Zhang, R., et al. Evidence for systemic immune system alterations in sporadic amyotrophic lateral sclerosis (sALS). Journal of Neuroimmunology. 159 (1-2), 215-224 (2005).
  5. Saleh, I. A., et al. Evaluation of humoral immune response in adaptive immunity in ALS patients during disease progression. Journal of Neuroimmunology. 215 (1-2), 6 (2009).
  6. Wang, M., et al. Evaluation of Peripheral Immune Activation in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Frontiers in Neurology. 12, 628710 (2021).
  7. Li, J. -. Y., et al. Blood-brain barrier dysfunction and myelin basic protein in survival of amyotrophic lateral sclerosis with or without frontotemporal dementia. Neurological Sciences. 43 (5), 3201-3210 (2022).
  8. Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis affects cytosolic Ca2+ homeostasis in cultured rat astrocytes. Cell Calcium. 54 (1), 17-25 (2013).
  9. Andjus, P. R., Stevic-Marinkovic, Z., Cherubini, E. Immunoglobulins from motoneurone disease patients enhance glutamate release from rat hippocampal neurones in culture. Journal of Physiology. 504, 103-112 (1997).
  10. Howland, D. S., et al. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (3), 1604-1609 (2002).
  11. Dučić, T., Stamenković, S., Lai, B., Andjus, P., Lučić, V. Multimodal synchrotron radiation microscopy of intact astrocytes from the hSOD1 G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Analytical Chemistry. 91 (2), 1460-1471 (2019).
  12. Popović-Bijelić, A., et al. Iron-sulfur cluster damage by the superoxide radical in neural tissues of the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 96, 313-322 (2016).
  13. Stamenković, S., et al. In vivo EPR pharmacokinetic evaluation of the redox status and the blood brain barrier permeability in the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 108, 258-269 (2017).
  14. Stamenković, S., Dučić, T., Stamenković, V., Kranz, A., Andjus, P. R. Imaging of glial cell morphology, SOD1 distribution and elemental composition in the brainstem and hippocampus of the ALS hSOD1(G93A) rat. Neuroscience. 357, 37-55 (2017).
  15. Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from sera of amyotrophic lateral sclerosis patients induce oxidative stress and upregulation of antioxidative system in BV-2 microglial cell line. Frontiers in Immunology. 8, 1619 (2017).
  16. Boillée, S., Cleveland, D. W. Revisiting oxidative damage in ALS: microglia, Nox, and mutant SOD1. Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 474-478 (2008).
  17. Boillée, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
  18. Martínez-Palma, L., et al. Mitochondrial modulation by dichloroacetate reduces toxicity of aberrant glial cells and gliosis in the SOD1G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of American Society for Experimental Neurotherapeutics. 16 (1), 203-215 (2019).
  19. Díaz-Amarilla, P., et al. Phenotypically aberrant astrocytes that promote motoneuron damage in a model of inherited amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), 18126-18131 (2011).
  20. Barbosa, M., et al. Recovery of depleted miR-146a in ALS cortical astrocytes reverts cell aberrancies and prevents paracrine pathogenicity on microglia and motor neurons. Frontiers in Cell Developmental Biology. 9, 634355 (2021).
  21. Gomes, C., et al. Astrocyte regional diversity in ALS includes distinct aberrant phenotypes with common and causal pathological processes. Experimental Cell Research. 395 (2), 112209 (2020).
  22. Kovacs, M., et al. CD34 identifies a subset of proliferating microglial cells associated with degenerating motor neurons in ALS. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3880 (2019).
  23. Komiya, H., et al. Ablation of interleukin-19 improves motor function in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Molecular Brain. 14 (1), 1-13 (2021).
  24. Trias, E., et al. Emergence of microglia bearing senescence markers during paralysis progression in a rat model of inherited ALS. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 1-14 (2019).
  25. Pullen, A. H., Demestre, M., Howard, R. S., Orrell, R. W. Passive transfer of purified IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis to mice results in degeneration of motor neurons accompanied by Ca2+ enhancement. Acta Neuropatholgica. 107 (1), 35-46 (2004).
  26. Obál, I., et al. Intraperitoneally administered IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis or from an immune-mediated goat model increase the levels of TNF-α, IL-10 in the spinal cord and serum of mice. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 121 (2016).
  27. Obál, I., et al. Experimental motor neuron disease induced in mice with long-term repeated intraperitoneal injections of serum from ALS patients. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2573 (2019).
  28. Mohamed, H. A., et al. Immunoglobulin Fc gamma receptor promotes immunoglobulin uptake, immunoglobulin-mediated calcium increase, and neurotransmitter release in motor neurons. Journal of Neuroscience Research. 69 (1), 110-116 (2002).
  29. Engelhardt, J. I., Siklos, L., Appel, S. H. Altered calcium homeostasis and ultrastructure in motoneurons of mice caused by passively transferred anti-motoneuronal IgG. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 56 (1), 21-39 (1997).
  30. Pagani, M. R., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Calcium signaling pathways mediating synaptic potentiation triggered by amyotrophic lateral sclerosis IgG in motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2661-2672 (2006).
  31. Carter, J. R., Mynlieff, M. Amyotrophic lateral sclerosis patient IgG alters voltage dependence of Ca2+ channels in dissociated rat motoneurons. Neuroscience Letters. 353 (3), 221-225 (2003).
  32. Fratantoni, S. A., Weisz, G., Pardal, A. M., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Amyotrophic lateral sclerosis IgG-treated neuromuscular junctions develop sensitivity to L-type calcium channel blocker. Muscle & Nerve. 23 (4), 543-550 (2000).
  33. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
  34. Vay, S. U., et al. The impact of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) and voltage-gated potassium KCNQ/Kv7 channels on primary microglia function. Journl of Neuroinflammation. 17 (1), 100 (2020).
  35. Bijelić, D. D., et al. Central nervous system-infiltrated immune cells induce calcium increase in astrocytes via astroglial purinergic signaling. Journal of Neuroscience Research. 98 (11), 2317-2332 (2020).
  36. Kawamata, H., et al. Abnormal intracellular calcium signaling and SNARE-dependent exocytosis contributes to SOD1G93A astrocyte-mediated toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2331-2348 (2014).
  37. Nims, R. W., Price, P. J. Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 53 (10), 872-879 (2017).
  38. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
  39. Adzic, M., et al. Extracellular ATP induces graded reactive response of astrocytes and strengthens their antioxidative defense in vitro. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1053-1066 (2017).
  40. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 198 (2020).
  41. Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nature Neuroscince. 17 (1), 131-143 (2014).
  42. Vankriekelsvenne, E., et al. Transmembrane protein 119 is neither a specific nor a reliable marker for microglia. Glia. 70 (6), 1170-1190 (2022).
  43. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).

Play Video

Cite This Article
Milićević, K., Korenić, A., Milošević, M., Andjus, P. R. Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (184), e63483, doi:10.3791/63483 (2022).

View Video