Primaire culturen van rat astrocyten en microglia en hun gebruik in de studie van amyotrofische laterale sclerose

Summary

We presenteren hier een protocol over het voorbereiden van primaire culturen van gliacellen, astrocyten en microglia uit rattencorticosterces voor time-lapse videobeeldvorming van intracellulaire Ca²⁺ voor onderzoek naar pathofysiologie van amyotrofische laterale sclerose in het hSOD1^{G93A-rattenmodel} .

Abstract

Dit protocol laat zien hoe primaire culturen van gliacellen, astrocyten en microglia kunnen worden bereid uit de cortices van Sprague Dawley-ratten en hoe deze cellen kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de pathofysiologie van amyotrofische laterale sclerose (ALS) in het rat hSOD1^G93A-model . Ten eerste laat het protocol zien hoe astrocyten en microglia uit postnatale rattencorticosterces kunnen worden geïsoleerd en gekweekt, en vervolgens hoe deze culturen kunnen worden gekarakteriseerd en getest op zuiverheid door immunocytochemie met behulp van de gliale fibrillaire zure eiwit (GFAP) marker van astrocyten en de geïoniseerde calciumbindende adaptermolecuul 1 (Iba1) microgliale marker. In de volgende fase worden methoden beschreven voor het laden van kleurstoffen (calciumgevoelige Fluo 4-AM) van gekweekte cellen en de opnames van Ca²⁺ veranderingen in videobeeldexperimenten op levende cellen.

De voorbeelden van video-opnames bestaan uit: (1) gevallen van Ca²⁺ beeldvorming van gekweekte astrocyten die acuut zijn blootgesteld aan immunoglobuline G (IgG) geïsoleerd van ALS-patiënten, met een karakteristieke en specifieke respons in vergelijking met de respons op ATP zoals aangetoond in hetzelfde experiment. Voorbeelden tonen ook een meer uitgesproken voorbijgaande stijging van de intracellulaire calciumconcentratie opgewekt door ALS IgG in hSOD1^G93A astrocyten in vergelijking met niet-transgene controles; (2) Ca²⁺ beeldvorming van gekweekte astrocyten tijdens een uitputting van calciumvoorraden door thapsigargin (Thg), een niet-competitieve remmer van het endoplasmatisch reticulum Ca²⁺ ATPase, gevolgd door opgeslagen calciuminvoer opgewekt door de toevoeging van calcium in de opnameoplossing, wat het verschil aantoont tussen Ca²⁺ winkelwerking in hSOD1^G93A en in niet-transgene astrocyten; (3) Ca²⁺ beeldvorming van de gekweekte microglia die voornamelijk een gebrek aan respons op ALS IgG laat zien, terwijl ATP-toepassing een Ca²⁺ verandering veroorzaakte. Dit artikel benadrukt ook mogelijke kanttekeningen en waarschuwingen met betrekking tot kritische celdichtheid en zuiverheid van culturen, waarbij de juiste concentratie van de Ca^{2 +} kleurstof- en kleurstoflaadtechnieken wordt gekozen.

Introduction

Celkweektechnieken hebben geleid tot tal van vooruitgang op verschillende gebieden van cellulaire neurofysiologie in gezondheid en ziekte. Met name primaire celculturen, vers geïsoleerd uit het neuronale weefsel van een proefdier, stellen de experimentator in staat om het gedrag van diverse cellen in verschillende biochemische media en fysiologische opstellingen nauwkeurig te bestuderen. Het gebruik van verschillende fluorescerende fysiologische indicatoren zoals de Ca²⁺-gevoelige kleurstoffen in combinatie met time-lapse videomicroscopie geeft in real time beter inzicht in de cellulaire biofysische en biochemische processen.

ALS is een verwoestende neurodegeneratieve ziekte die de bovenste en onderste motorneuronen^{aantast 1}. De ziekte heeft een complexe pathogenese van het familiale type, maar meestal van de sporadische vorm (90% van de gevallen)². Het is bekend dat niet-cel autonome mechanismen bijdragen aan de PATHOFYSIOLOGIE VAN ALS, voornamelijk vanwege de essentiële rol van gliacellen³. ALS wordt ook goed gekarakteriseerd als een neuro-inflammatoire ziekte met betrokkenheid van humorale en cellulaire ontstekingsfactoren.

Immunoglobuline G wordt veel gebruikt als moleculaire marker bij ALS en andere neurodegeneratieve ziekten. Het bestuderen van het serumniveau van deze marker kan wijzen op de aanwezigheid en het stadium van neuro-inflammatie bij de ziekte ^4,5,6, terwijl de aanwezigheid ervan in het hersenvocht kan wijzen op een doorbraak van de bloed-hersenbarrière⁷. IKG’s werden ook geïdentificeerd als afzettingen in de motorneuronen van het ruggenmerg van ALS-patiënten⁷. Niettemin heeft deze benadering enkele inconsistenties aangetoond in de correlatie van het niveau van IgG’s met het stadium en de kenmerken van de ziekte⁶.

IgG geïsoleerd uit de sera van ALS-patiënten (ALS IgG) kan een calciumrespons induceren in naïeve astrocyten⁸ en glutamaatafgifte in neuronen, wat wijst op een excitotoxisch effect – een kenmerk van ALS-pathologie⁹. Studies naar het hSOD1^G93A ALS-rattenmodel (met meerdere kopieën van de menselijke SOD1-mutatie¹⁰) toonden echter een aantal markers van oxidatieve stress in gekweekte neurogliale cellen¹¹, weefsels 12,13,14 of levende dieren ¹³. Het is opmerkelijk dat de astrocyten gekweekt uit het ALS-rattenmodel meer vatbaar waren voor oxidatieve stress veroorzaakt door peroxide dan de astroglia van niet-transgene nestgenoten¹¹.

Microgliale cellen in cultuur worden op een minder duidelijke manier beïnvloed door ALS IgG. Een BV-2 microgliale cellijn vertoonde namelijk een stijging van het signaal van fluorescerende markers van oxidatieve stress als reactie op de toepassing van slechts 4/11 ALS IgG-patiëntenmonsters¹⁵. Het is bekend dat microglia deelnemen aan vele neuro-inflammatoire pathologieën, wat bijdraagt aan oxidatieve stress en late progressiefase in het niet-cel autonome mechanisme van ALS ^16,17. Niettemin gaven de gegevens met ALS IgG’s aan dat deze cellen mogelijk niet zo reactief zijn als astrocyten op deze humorale factoren van ALS-ontsteking. Er zijn verschillende studies uitgevoerd met primaire astrocyten van ALS-muizenmodellen, niet alleen bij pups maar ook bij symptomatische dieren, hetzij op de hersenen of op het ruggenmerg 18,19,20,21. Dit geldt ook voor microgliale primaire culturen, hoewel in mindere mate dan astrocyten en meestal uit hersengebieden in het embryonale stadium 22,23,24.

We gebruiken time-lapse video beeldvorming van Ca²⁺ op cellen in cultuur voornamelijk als een middel om intracellulaire transiënten van dit ion te volgen als een fysiologische marker van excitotoxiciteit. Dus door biofysische karakterisering van deze transiënten (amplitude, gebied onder transiënt, rise-time, frequentie) kan de onderzoeker experimentele diagnostische parameters verkrijgen uit verschillende cellulaire modellen van neurodegeneratie. Deze techniek biedt dus een voordeel van een kwantitatieve fysiologische beoordeling van IKG’s als ziektebiomarkers. Er is een grote hoeveelheid literatuur over de rol van IgG’s en Ca²⁺ bij de inductie van ALS. De meeste van deze studies werden uitgevoerd door ALS te induceren door patiënt IgG’s in proefdieren^te injecteren 25,26,27,28,29, die vervolgens intracellulaire Ca²⁺ verhoging en IgG-afzettingen vertoonden. Een reeks studies onderzocht het effect van ALS IKG’s op de motorische synaps in vitro 30,31,32. In de bovenstaande context legt de hier gepresenteerde techniek de focus op de gliacellen als belangrijke spelers in het niet-cel autonome mechanisme van ALS en kwantificeert hun potentiële excitotoxische reactie op IgG’s als humorale factoren van neuro-inflammatie. Deze aanpak kan een bredere toepassing hebben bij het testen van andere humorale factoren zoals hele sera, CSF of cytokines in verschillende celkweeksystemen en in cellulaire modellen van algemene ontsteking.

Dit artikel beschrijft hoe primaire culturen van gliacellen, astrocyten en microglia kunnen worden bereid uit de cortices van Sprague Dawley-ratten en hoe deze cellen verder kunnen worden gebruikt om ALS-pathofysiologie te bestuderen met van sera afgeleide IgG van patiënten. Protocollen zijn gedetailleerd voor het laden van kleurstof van gekweekte cellen (figuur 1) en de opnames van Ca²⁺ veranderingen in time-lapse videobeeldvormingsexperimenten. Voorbeelden van video-opnames zullen laten zien hoe gliacellen reageren op ALS IgG in vergelijking met ATP, waarbij de laatste purinerge membraanreceptoren activeert. Voor het eerst wordt een voorbeeld getoond over hoe astrocyten geïsoleerd uit de hSOD1^G93A ALS-rattenhersenen reageren met een meer uitgesproken Ca²⁺ respons op ALS IgG in vergelijking met niet-transgene controles en hoe dit proces te relateren aan de verschillen in Ca²⁺ winkelwerking. Ook is een voorbeeld getoond van calciumbeeldvorming in microgliale cellen die acuut worden uitgedaagd met ALS IgG, met slechts een bescheiden respons van intracellulair calcium.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de EU-richtlijnen inzake de bescherming van dieren voor wetenschappelijke doeleinden en met toestemming van de Ethische Commissie van de Faculteit Biologie, Universiteit van Belgrado (goedkeuringsnummer EK-BF-2016/08). Met betrekking tot patiëntenmateriaal (sera voor IgG’s) werd het verzameld voor routinematig klinisch onderzoek met toestemming van de geïnformeerde patiënt in overeenstemming met de ethische code van de World Medical Association (Verklaring van…

Representative Results

Karakterisering van verschillende gliaceltypen in cultuurHet duurt meestal 15-21 dagen om astrocyten te produceren voor experimenten, terwijl microgliale cellen 10-15 dagen nodig hebben om te groeien. Immunostaining werd uitgevoerd om de celzuiverheid van de kweek te beoordelen. Figuur 1 toont de expressie van dubbele labeling van de astrocytische marker GFAP en de microgliale marker Iba1 in respectievelijke culturen. Van calciumbeeldvorming i…

Discussion

Dit artikel presenteert de methode van primaire celkweek als een snelle en “on the budget” tool voor het bestuderen van verschillende aspecten van cel (patho)fysiologie zoals ALS in het rat hSOD1^G93A model. De techniek is dus geschikt voor studies op het niveau van één cel die kunnen worden geëxtrapoleerd en verder kunnen worden onderzocht op een hoger organisatieniveau (d.w.z. in weefselplakken of bij een levend dier). Celkweek als techniek heeft echter een paar kanttekeningen. Het is het meest cruciaal om…

Materials

15 mL tube	Sarstedt, Germany	62 554 502
2 mL tube	Sarstedt, Germany	72.691
21 G needle	Nipro, Japan	HN-2138-ET
23 G needle	Nipro, Japan	HN-2338-ET
5 mL syringe	Nipro, Japan	SY3-5SC-EC
6 mm circular glass coverslip	Menzel Glasser, Germany	630-2113
60 mm Petri dish	ThermoFisher Sientific, USA	130181
ATP	Sigma-Aldrich, Germany	A9062
AxioObserver A1	Carl Zeiss, Germany
Bovine serum albumine	Sigma-Aldrich, Germany	B6917
Calcium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	2110
Centrifuge	Eppendorf, Germany
DAPI	Sigma-Aldrich, Germany	10236276001
D-glucose	Sigma-Aldrich, Germany	158968
DMEM	Sigma-Aldrich, Germany	D5648
Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody	Invitrogen, USA	A-21447
Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody	Invitrogen, USA	A-21202
EDTA	Sigma-Aldrich, Germany	EDS-100G
EGTA	Sigma-Aldrich, Germany	E4378
”evolve”-EM 512 Digital Camera System	Photometrics, USA
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	10500064
Fiji ImageJ Software	Open source under the GNU General Public Licence
FITC filter set	Chroma Technology Inc., USA
Fluo-4 AM	Molecular Probes, USA	F14201
Goat anti-Iba1	Fujifilm Wako Chemicals, USA	011-27991
HEPES	Biowest, France	P5455
HighSpeed Solution Exchange System	ALA Scientific Instruments, USA
Incubator	Memmert GmbH + Co. KG, Germany
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	M2393
Matlab software	Math Works, USA
Mouse anti-GFAP	Merck Millipore, USA	MAB360
Mowiol 40-88	Sigma-Aldrich, Germany	324590
Normal donkey serum	Sigma-Aldrich, Germany	D9663
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, Germany	158127
Penicilin and Streptomycin	ThermoFisher Sientific, USA	15140122
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich, Germany	P5899
Potassium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	P5405
Potassium dihydrogen phosphate	Carlo Erba Reagents, Spain	471686
Shaker DELFIA PlateShake	PerkinElmer Life Sciencies, USA
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, Germany	S3817
Sodium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	S5886
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Carl ROTH GmbH	X987.2
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich, Germany	P5280
Thapsigargine	Tocris Bioscience, UK	1138
Triton X – 100	Sigma-Aldrich, Germany	T8787
Trypsin	Sigma-Aldrich, Germany	T4799
Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520	Wescor, ELITechGroup Inc., USA
ViiFluor Imaging System	Visitron System Gmbh, Germany
VisiChrome Polychromator System	Visitron System Gmbh, Germany
VisiView high performance setup	Visitron System Gmbh, Germany
Xenon Short Arc lamp	Ushio, Japan