Summary

Culturas Primárias de Astrócitos de Rato e Microglia e Seu Uso no Estudo da Esclerose Lateral Amiotrófica

Published: June 23, 2022
doi:

Summary

Apresentamos aqui um protocolo sobre como preparar culturas primárias de células gliais, astrócitos e micróglias de córtices de ratos para imagens de vídeo de lapso de tempo de Ca2+ intracelular para pesquisa sobre fisiopatologia da esclerose lateral amiotrófica no modelo de rato hSOD1G93A .

Abstract

Este protocolo demonstra como preparar culturas primárias de células gliais, astrócitos e micróglia a partir dos córtices de ratos Sprague Dawley e como usar essas células com a finalidade de estudar a fisiopatologia da esclerose lateral amiotrófica (ELA) no modelo hSOD1G93A de ratos. Primeiro, o protocolo mostra como isolar e cultivar astrócitos e micróglias de córtices de ratos pós-natais e, em seguida, como caracterizar e testar a pureza dessas culturas por imunocitoquímica usando o marcador de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de astrócitos e o marcador microglial da molécula adaptadora de ligação ao cálcio ionizado 1 (Iba1). Na próxima etapa, são descritos métodos para o carregamento de corantes (Fluo 4-AM sensível ao cálcio) de células cultivadas e as gravações de alterações de Ca2+ em experimentos de imagem de vídeo em células vivas.

Os exemplos de gravações de vídeo consistem em: (1) casos de imagem de Ca2+ de astrócitos cultivados agudamente expostos à imunoglobulina G (IgG) isolados de pacientes com ELA, mostrando uma resposta característica e específica em comparação com a resposta ao ATP, conforme demonstrado no mesmo experimento. Exemplos também mostram um aumento transitório mais pronunciado na concentração intracelular de cálcio evocada pela ELA IgG em astrócitos hSOD1G93A em comparação com controles não transgênicos; (2) Imagem Ca 2+ de astrócitos cultivados durante uma depleção dos estoques de cálcio pela thapsigargina (Thg), um inibidor não competitivo do retículo endoplasmático Ca 2+ ATPase, seguido pela entrada de cálcio operada em armazém provocada pela adição de cálcio na solução de registro, o que demonstra a diferença entre a operação de armazenamento de Ca2+ em hSOD1G93A e em astrócitos não transgênicos; (3) Imagens de Ca 2+ da micróglia cultivada mostraram predominantemente uma falta de resposta à IgG da ELA, enquanto a aplicação de ATP provocou uma alteração de Ca2+. Este artigo também enfatiza possíveis ressalvas e advertências em relação à densidade celular crítica e pureza das culturas, escolhendo a concentração correta do corante Ca2+ e das técnicas de carregamento de corantes.

Introduction

As técnicas de cultura de células deram origem a inúmeros avanços em diversos campos da neurofisiologia celular na saúde e na doença. Particularmente, as culturas de células primárias, recém-isoladas do tecido neuronal de um animal de laboratório, permitem que o experimentador estude de perto o comportamento de diversas células em diferentes meios bioquímicos e configurações fisiológicas. O uso de diferentes indicadores fisiológicos fluorescentes, como os corantes sensíveis ao Ca2+, em combinação com a microscopia de vídeo de lapso de tempo, fornece uma melhor visão dos processos biofísicos e bioquímicos celulares em tempo real.

A ELA é uma doença neurodegenerativa devastadora que afeta os neurônios motores superiores e inferiores1. A doença tem uma patogênese complexa do tipo familiar, mas principalmente da forma esporádica (90% dos casos)2. Sabe-se que mecanismos autônomos não celulares contribuem para a fisiopatologia da ELA, principalmente devido ao papel essencial das células gliais3. A ELA também é bem caracterizada como uma doença neuroinflamatória com envolvimento de fatores humorais e celulares de inflamação.

A imunoglobulina G é amplamente utilizada como marcador molecular na ELA e em outras doenças neurodegenerativas. Estudar o nível sérico desse marcador pode indicar a presença e o estágio da neuroinflamação na doença 4,5,6, enquanto sua presença no líquido cefalorraquidiano pode indicar uma violação da barreira hematoencefálica 7. IgGs também foram identificadas como depósitos nos neurônios motores da medula espinhal de pacientes com ELA7. No entanto, essa abordagem tem mostrado algumas inconsistências na correlação do nível de IgGs com o estágio e as características da doença6.

A IgG isolada dos soros de pacientes com ELA (ALS IgG) pode induzir uma resposta de cálcio em astrócitos ingênuos8 e liberação de glutamato em neurônios, apontando para um efeito excitotóxico – uma característica da patologia da ELA9. No entanto, estudos sobre o modelo de camundongo HSA hSOD1G93A (contendo múltiplas cópias da mutação humanaSOD1 10) mostraram uma série de marcadores de estresse oxidativo em células neurogliais cultivadas 11, tecidos 12,13,14 ou animais vivos 13. Ressalta-se que os astrócitos cultivados a partir do modelo de ratos com ELA foram mais propensos ao estresse oxidativo induzido pelo peróxido do que a astroglia de companheiros de ninhada não transgênicos11.

As células microgliais em cultura são afetadas pela ELA IgG de forma menos aparente. Ou seja, uma linhagem celular microglial BV-2 apresentou um aumento no sinal de marcadores fluorescentes de estresse oxidativo em resposta à aplicação de apenas 4/11 amostras de pacientes com ELA IgG15. Sabe-se que a micróglia participa de muitas patologias neuroinflamatórias, aumentando o estresse oxidativo e a fase de progressão tardia no mecanismo autônomo não celular da ELA16,17. No entanto, os dados com IgGs da ELA indicaram que essas células podem não ser tão reativas quanto os astrócitos a esses fatores humorais da inflamação da ELA. Vários estudos têm sido realizados com astrócitos primários de modelos murinos de ELA, não apenas em filhotes, mas também em animais sintomáticos, seja no cérebro ou na medula espinhal 18,19,20,21. Isso também é verdade para culturas primárias microgliais, embora em menor grau do que os astrócitos e principalmente de regiões cerebrais no estágio embrionário22,23,24.

Usamos imagens de vídeo de lapso de tempo de Ca2+ em células em cultura principalmente como um meio de seguir os transientes intracelulares deste íon como um marcador fisiológico de excitotoxicidade. Assim, pela caracterização biofísica desses transientes (amplitude, área sob transiente, tempo de subida, frequência) o pesquisador pode obter parâmetros diagnósticos experimentais a partir de diversos modelos celulares de neurodegeneração. Esta técnica oferece, portanto, uma vantagem de uma avaliação fisiológica quantitativa de IgGs como biomarcadores da doença. Há um grande corpo de literatura sobre o papel das IgGs e Ca2+ na indução da ELA. A maioria desses estudos foi realizada induzindo ELA injetando IgGs de pacientes em animais experimentais 25,26,27,28,29, que então mostraram elevação intracelular de Ca 2+ e deposições de IgG. Uma linha de estudos explorou o efeito da ELA IgGs na sinapse motora in vitro30,31,32. No contexto acima, a técnica aqui apresentada coloca o foco nas células gliais como atores importantes no mecanismo autônomo não celular da ELA e quantifica sua potencial resposta excitotóxica às IgGs como fatores humorais da neuroinflamação. Essa abordagem pode ter uma aplicação mais ampla no teste de outros fatores humorais como soros inteiros, LCR ou citocinas em diferentes sistemas de cultura celular e em modelos celulares de inflamação geral.

Este artigo descreve como preparar culturas primárias de células gliais, astrócitos e micróglia a partir dos córtices de ratos Sprague Dawley e como usar essas células para estudar a fisiopatologia da ELA com IgG derivada de soros de pacientes. Os protocolos são detalhados para o carregamento de corante de células cultivadas (Figura 1) e as gravações de alterações de Ca2+ em experimentos de imagem de vídeo de lapso de tempo. Exemplos de gravações de vídeo mostrarão como as células gliais reagem à ALS IgG em comparação com o ATP, este último ativando os receptores de membrana purinérgicos. Mostrado pela primeira vez é um exemplo de como os astrócitos isolados do cérebro de ratos hSOD1G93A ALS reagem com uma resposta mais pronunciada de Ca 2+ à ALS IgG em comparação com controles não transgênicos e como relacionar esse processo com as diferenças na operação de armazenamento de Ca2+. Também é mostrado um exemplo de imagem de cálcio em células microgliais agudamente desafiadas com ALS IgG, com apenas uma resposta modesta de cálcio intracelular.

Protocol

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretivas da UE sobre a proteção de animais para fins científicos e com permissão da Comissão de Ética da Faculdade de Biologia da Universidade de Belgrado (número de aprovação EK-BF-2016/08). Em relação ao material do paciente (soros para IgGs), este foi coletado para exame clínico de rotina com o consentimento informado do paciente, de acordo com o Código de Ética da Associação Médica Mundial (Declaração de Helsinque) para experimentos envolvend…

Representative Results

Caracterização de diferentes tipos de células gliais em culturaGeralmente leva de 15 a 21 dias para produzir astrócitos para experimentos, enquanto as células microgliais levam de 10 a 15 dias para crescer. A imunocoloração foi realizada para avaliar a pureza celular da cultura. A Figura 1 mostra a expressão da dupla marcação do marcador astrocítico GFAP e do marcador microglial Iba1 nas respectivas culturas. Sabe-se que a imagem de…

Discussion

Este trabalho apresenta o método de cultura celular primária como uma ferramenta rápida e “dentro do orçamento” para o estudo de diferentes aspectos da fisiologia celular (pato), como a ELA, no modelo hSOD1G93A de ratos. A técnica é, portanto, adequada para estudos no nível de célula única que podem ser extrapolados e investigados em um nível mais alto de organização (ou seja, em fatias de tecido ou em um animal vivo). A cultura celular como técnica, no entanto, tem algumas ressalvas. É mais impo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Educação, Contrato de Ciência e Desenvolvimento Tecnológico da República da Sérvia nº 451-03-9/2021-14 / 200178, o projeto FENS – NENS Education and Training Cluster “Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation” e o EC H2020 MSCA RISE grant #778405. Agradecemos a Marija Adžić e Mina Perić por fornecerem as imagens imuno-histoquímicas e a Danijela Bataveljić por ajudarem com a escrita em papel.

Materials

15 mL tube Sarstedt, Germany 62 554 502
2 mL tube Sarstedt, Germany 72.691
21 G needle Nipro, Japan HN-2138-ET
23 G needle Nipro, Japan HN-2338-ET
5 mL syringe Nipro, Japan SY3-5SC-EC
6 mm circular glass coverslip Menzel Glasser, Germany 630-2113
60 mm Petri dish ThermoFisher Sientific, USA 130181
ATP Sigma-Aldrich, Germany A9062
AxioObserver A1 Carl Zeiss, Germany
Bovine serum albumine Sigma-Aldrich, Germany B6917
Calcium chloride Sigma-Aldrich, Germany 2110
Centrifuge Eppendorf, Germany
DAPI Sigma-Aldrich, Germany 10236276001
D-glucose Sigma-Aldrich, Germany 158968
DMEM Sigma-Aldrich, Germany D5648
Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody Invitrogen, USA A-21447
Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody Invitrogen, USA A-21202
EDTA Sigma-Aldrich, Germany EDS-100G
EGTA Sigma-Aldrich, Germany E4378
”evolve”-EM 512 Digital Camera System Photometrics, USA
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, ThermoFisher Scientific, USA 10500064
Fiji ImageJ Software Open source under the GNU General Public Licence
FITC filter set Chroma Technology Inc., USA
Fluo-4 AM Molecular Probes, USA F14201
Goat anti-Iba1 Fujifilm Wako Chemicals, USA 011-27991
HEPES Biowest, France P5455
HighSpeed Solution Exchange System ALA Scientific Instruments, USA
Incubator Memmert GmbH + Co. KG, Germany
Magnesium chloride Sigma-Aldrich, Germany M2393
Matlab software Math Works, USA
Mouse anti-GFAP Merck Millipore, USA MAB360
Mowiol 40-88 Sigma-Aldrich, Germany 324590
Normal donkey serum Sigma-Aldrich, Germany D9663
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich, Germany 158127
Penicilin and Streptomycin ThermoFisher Sientific, USA 15140122
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich, Germany P5899
Potassium chloride Sigma-Aldrich, Germany P5405
Potassium dihydrogen phosphate Carlo Erba Reagents, Spain 471686
Shaker DELFIA PlateShake PerkinElmer Life Sciencies, USA
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, Germany S3817
Sodium chloride Sigma-Aldrich, Germany S5886
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Carl ROTH GmbH X987.2
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich, Germany P5280
Thapsigargine Tocris Bioscience, UK 1138
Triton X – 100 Sigma-Aldrich, Germany T8787
Trypsin Sigma-Aldrich, Germany T4799
Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520 Wescor, ELITechGroup Inc., USA
ViiFluor Imaging System Visitron System Gmbh, Germany
VisiChrome Polychromator System Visitron System Gmbh, Germany
VisiView high performance setup Visitron System Gmbh, Germany
Xenon Short Arc lamp Ushio, Japan

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Milićević, K., Korenić, A., Milošević, M., Andjus, P. R. Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (184), e63483, doi:10.3791/63483 (2022).

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