Summary

Первичные культуры астроцитов и микроглии крыс и их использование в изучении бокового амиотрофического склероза

Published: June 23, 2022
doi:

Summary

Мы представляем здесь протокол о том, как подготовить первичные культуры глиальных клеток, астроцитов и микроглии из коры крыс для покадровой видеовизуализации внутриклеточного Ca2+ для исследования патофизиологии бокового амиотрофического склероза в модели крыс hSOD1G93A .

Abstract

Этот протокол демонстрирует, как подготовить первичные культуры глиальных клеток, астроцитов и микроглий из коры крыс Sprague Dawley и как использовать эти клетки с целью изучения патофизиологии бокового амиотрофического склероза (БАС) в модели hSOD1G93A крыс. Сначала протокол показывает, как изолировать и культивировать астроциты и микроглию из постнатальной коры крыс, а затем как охарактеризовать и проверить эти культуры на чистоту иммуноцитохимией с использованием маркера глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) астроцитов и ионизированного кальций-связывающего адапторного молекулы 1 (Iba1) микроглиального маркера. На следующем этапе описаны методы загрузки красителем (кальций-чувствительный Fluo 4-AM) культивируемых клеток и записи изменений Ca2+ в экспериментах видеовизуализации на живых клетках.

Примеры видеозаписей состоят из: (1) случаев визуализации Ca2+ культивируемых астроцитов, остро подвергшихся воздействию иммуноглобулина G (IgG), выделенного у пациентов с БАС, демонстрируя характерный и специфический ответ по сравнению с ответом на АТФ, как было продемонстрировано в том же эксперименте. Примеры также показывают более выраженное преходящее повышение внутриклеточной концентрации кальция, вызванное ALS IgG в астроцитах hSOD1G93A по сравнению с нетрансгенным контролем; (2) Ca2+ визуализация культивируемых астроцитов во время истощения запасов кальция тапсигаргином (Thg), неконкурентным ингибитором эндоплазматического ретикулума Ca2+ АТФазы, с последующим поступлением кальция в хранилище, вызванным добавлением кальция в регистрирующий раствор, что демонстрирует разницу между работой хранилища Ca2+ в hSOD1G93A и в нетрансгенных астроцитах; (3) Визуализация культивируемой микроглии Ca2+ , показывающая преимущественно отсутствие реакции на ALS IgG, тогда как применение АТФ вызвало изменение Ca2+ . В этой статье также подчеркиваются возможные предостережения и предостережения относительно критической плотности клеток и чистоты культур, выбора правильной концентрации красителя Ca2+ и методов загрузки красителя.

Introduction

Методы культивирования клеток привели к многочисленным достижениям в различных областях клеточной нейрофизиологии в области здравоохранения и болезней. В частности, первичные клеточные культуры, недавно выделенные из нейронной ткани лабораторного животного, позволяют экспериментатору внимательно изучать поведение различных клеток в различных биохимических средах и физиологических установках. Использование различных флуоресцентных физиологических показателей, таких как чувствительные красители Ca2+, в сочетании с покадровой видеомикроскопией обеспечивает лучшее понимание клеточных биофизических и биохимических процессов в режиме реального времени.

БАС является разрушительным нейродегенеративным заболеванием, которое поражает верхние и нижние двигательные нейроны1. Заболевание имеет сложный патогенез семейного типа, но преимущественно спорадической формы (90% случаев)2. Хорошо известно, что неклеточные автономные механизмы способствуют патофизиологии БАС, в первую очередь из-за существенной роли глиальных клеток3. БАС также хорошо характеризуется как нейровоспалительное заболевание с участием гуморальных и клеточных факторов воспаления.

Иммуноглобулин G широко используется в качестве молекулярного маркера при БАС и других нейродегенеративных заболеваниях. Изучение сывороточного уровня этого маркера может свидетельствовать о наличии и стадии нейровоспаления при заболевании 4,5,6, в то время как его наличие в спинномозговой жидкости может свидетельствовать о нарушении гематоэнцефалического барьера7. IgGs также были идентифицированы как отложения в двигательных нейронах спинного мозга пациентов с БАС7. Тем не менее, данный подход показал некоторые несоответствия в соотношении уровня IgGs со стадией и особенностями заболевания6.

IgG, выделенный из сывороток пациентов с БАС (ALS IgG), может индуцировать кальциевый ответ в наивных астроцитах8 и высвобождение глутамата в нейронах, указывая на экситотоксический эффект – отличительный признак патологии БАС9. Однако исследования на крысиной модели hSOD1G93A ALS (содержащей множественные копии человеческой мутации SOD110) показали ряд маркеров окислительного стресса в культивируемых нейроглиальных клетках11, тканях 12,13,14 или живых животных 13. Примечательно, что астроциты, культивируемые из модели крыс с БАС, были более склонны к окислительному стрессу, вызванному перекисью, чем астроглия у нетрансгенных пометников11.

Клетки микроглии в культуре подвергаются воздействию ALS IgG менее очевидным образом. А именно, линия микроглиальных клеток BV-2 показала повышение сигнала от флуоресцентных маркеров окислительного стресса в ответ на применение только 4/11 ALS IgG образцов пациента15. Хорошо известно, что микроглии участвуют во многих нейровоспалительных патологиях, добавляя к окислительному стрессу и поздней фазе прогрессирования в неклеточном автономном механизме БАС16,17. Тем не менее, данные с ALS IgGs показали, что эти клетки могут быть не такими реактивными, как астроциты, на эти гуморальные факторы воспаления БАС. Было проведено несколько исследований с первичными астроцитами из мышиных моделей БАС не только у детенышей, но и у симптоматических животных, либо на головном, либо на спинном мозге 18,19,20,21. Это также верно для первичных культур микроглии, хотя и в меньшей степени, чем астроциты и в основном из областей мозга на эмбриональной стадии 22,23,24.

Мы используем покадровую видеовизуализацию Ca2+ на клетках в культуре в первую очередь как средство для отслеживания внутриклеточных переходных процессов этого иона в качестве физиологического маркера экситотоксичности. Таким образом, путем биофизической характеристики этих переходных процессов (амплитуда, площадь под переходным процессом, время нарастания, частота) исследователь может получить экспериментальные диагностические параметры из различных клеточных моделей нейродегенерации. Таким образом, этот метод дает преимущество количественной физиологической оценки IgGs как биомаркеров заболевания. Существует большое количество литературы о роли IgGs и Ca2+ в индукции БАС. Большинство из этих исследований были выполнены путем индуцирования БАС путем введения пациенту IgGs экспериментальным животным 25,26,27,28,29, которые затем показали внутриклеточное повышение Ca2+ и IgG. В ряде исследований изучалось влияние ALS IgGs на моторный синапс in vitro 30,31,32. В приведенном выше контексте метод, представленный здесь, фокусируется на глиальных клетках как важных игроках в неклеточном автономном механизме БАС и количественно оценивает их потенциальный экситотоксический ответ на IgGs как гуморальные факторы нейровоспаления. Этот подход может иметь более широкое применение при тестировании других гуморальных факторов, таких как целые сыворотки, ликвор или цитокины в различных системах клеточных культур и в клеточных моделях общего воспаления.

В этой статье описывается, как подготовить первичные культуры глиальных клеток, астроцитов и микроглии из коры крыс Sprague Dawley и как в дальнейшем использовать эти клетки для изучения патофизиологии БАС с помощью IgG, полученного из сыворотки пациента. Протоколы подробно описаны для загрузки красителем культивируемых клеток (рисунок 1) и записей изменений Ca2+ в экспериментах с покадровой видеоизображением. Примеры видеозаписей покажут, как глиальные клетки реагируют на ALS IgG по сравнению с АТФ, последний активирует пуринергические мембранные рецепторы. Впервые показан пример того, как астроциты, выделенные из мозга крысы hSOD1G93A ALS , реагируют с более выраженным ответом Ca2+ на ALS IgG по сравнению с нетрансгенным контролем и как связать этот процесс с различиями в работе магазина Ca2+ . Также показан пример визуализации кальция в клетках микроглии, остро оспариваемых ALS IgG, с лишь скромным ответом внутриклеточного кальция.

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с директивами ЕС по защите животных в научных целях и с разрешения Этической комиссии биологического факультета Белградского университета (номер одобрения EK-BF-2016/08). Что касается материала пациента (сыворотки для IgGs), то он был собран для пла?…

Representative Results

Характеристика различных типов глиальных клеток в культуреОбычно для производства астроцитов для экспериментов требуется 15-21 день, в то время как микроглиальным клеткам требуется 10-15 дней, чтобы вырасти. Иммуноокрашивание проводили для оценки клеточной чистоты культуры. <s…

Discussion

В данной работе представлен метод первичного культивирования клеток как быстрый и «бюджетный» инструмент для изучения различных аспектов клеточной (пато)физиологии, таких как БАС в модели hSOD1G93A крыс. Таким образом, метод подходит для исследований на одноклеточном уровне, которы?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Договором Министерства образования, науки и технологического развития Республики Сербия No 451-03-9/2021-14/200178, проектом образовательного и учебного кластера FENS – NENS «Трехсторонний курс по глии в нейровоспалении» и грантом ЕС H2020 MSCA RISE #778405. Мы благодарим Марию Аджич и Мину Перич за предоставление изображений иммуногистохимии и Даниэлу Батавельич за помощь в написании статьи.

Materials

15 mL tube Sarstedt, Germany 62 554 502
2 mL tube Sarstedt, Germany 72.691
21 G needle Nipro, Japan HN-2138-ET
23 G needle Nipro, Japan HN-2338-ET
5 mL syringe Nipro, Japan SY3-5SC-EC
6 mm circular glass coverslip Menzel Glasser, Germany 630-2113
60 mm Petri dish ThermoFisher Sientific, USA 130181
ATP Sigma-Aldrich, Germany A9062
AxioObserver A1 Carl Zeiss, Germany
Bovine serum albumine Sigma-Aldrich, Germany B6917
Calcium chloride Sigma-Aldrich, Germany 2110
Centrifuge Eppendorf, Germany
DAPI Sigma-Aldrich, Germany 10236276001
D-glucose Sigma-Aldrich, Germany 158968
DMEM Sigma-Aldrich, Germany D5648
Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody Invitrogen, USA A-21447
Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody Invitrogen, USA A-21202
EDTA Sigma-Aldrich, Germany EDS-100G
EGTA Sigma-Aldrich, Germany E4378
”evolve”-EM 512 Digital Camera System Photometrics, USA
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, ThermoFisher Scientific, USA 10500064
Fiji ImageJ Software Open source under the GNU General Public Licence
FITC filter set Chroma Technology Inc., USA
Fluo-4 AM Molecular Probes, USA F14201
Goat anti-Iba1 Fujifilm Wako Chemicals, USA 011-27991
HEPES Biowest, France P5455
HighSpeed Solution Exchange System ALA Scientific Instruments, USA
Incubator Memmert GmbH + Co. KG, Germany
Magnesium chloride Sigma-Aldrich, Germany M2393
Matlab software Math Works, USA
Mouse anti-GFAP Merck Millipore, USA MAB360
Mowiol 40-88 Sigma-Aldrich, Germany 324590
Normal donkey serum Sigma-Aldrich, Germany D9663
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich, Germany 158127
Penicilin and Streptomycin ThermoFisher Sientific, USA 15140122
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich, Germany P5899
Potassium chloride Sigma-Aldrich, Germany P5405
Potassium dihydrogen phosphate Carlo Erba Reagents, Spain 471686
Shaker DELFIA PlateShake PerkinElmer Life Sciencies, USA
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, Germany S3817
Sodium chloride Sigma-Aldrich, Germany S5886
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Carl ROTH GmbH X987.2
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich, Germany P5280
Thapsigargine Tocris Bioscience, UK 1138
Triton X – 100 Sigma-Aldrich, Germany T8787
Trypsin Sigma-Aldrich, Germany T4799
Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520 Wescor, ELITechGroup Inc., USA
ViiFluor Imaging System Visitron System Gmbh, Germany
VisiChrome Polychromator System Visitron System Gmbh, Germany
VisiView high performance setup Visitron System Gmbh, Germany
Xenon Short Arc lamp Ushio, Japan

References

  1. Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
  2. Taylor, J. P., Brown, R. H. J., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
  3. Gleichman, A. J., Carmichael, S. T. Glia in neurodegeneration: Drivers of disease or along for the ride. Neurobiology of Disease. 142, 104957 (2022).
  4. Zhang, R., et al. Evidence for systemic immune system alterations in sporadic amyotrophic lateral sclerosis (sALS). Journal of Neuroimmunology. 159 (1-2), 215-224 (2005).
  5. Saleh, I. A., et al. Evaluation of humoral immune response in adaptive immunity in ALS patients during disease progression. Journal of Neuroimmunology. 215 (1-2), 6 (2009).
  6. Wang, M., et al. Evaluation of Peripheral Immune Activation in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Frontiers in Neurology. 12, 628710 (2021).
  7. Li, J. -. Y., et al. Blood-brain barrier dysfunction and myelin basic protein in survival of amyotrophic lateral sclerosis with or without frontotemporal dementia. Neurological Sciences. 43 (5), 3201-3210 (2022).
  8. Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis affects cytosolic Ca2+ homeostasis in cultured rat astrocytes. Cell Calcium. 54 (1), 17-25 (2013).
  9. Andjus, P. R., Stevic-Marinkovic, Z., Cherubini, E. Immunoglobulins from motoneurone disease patients enhance glutamate release from rat hippocampal neurones in culture. Journal of Physiology. 504, 103-112 (1997).
  10. Howland, D. S., et al. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (3), 1604-1609 (2002).
  11. Dučić, T., Stamenković, S., Lai, B., Andjus, P., Lučić, V. Multimodal synchrotron radiation microscopy of intact astrocytes from the hSOD1 G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Analytical Chemistry. 91 (2), 1460-1471 (2019).
  12. Popović-Bijelić, A., et al. Iron-sulfur cluster damage by the superoxide radical in neural tissues of the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 96, 313-322 (2016).
  13. Stamenković, S., et al. In vivo EPR pharmacokinetic evaluation of the redox status and the blood brain barrier permeability in the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 108, 258-269 (2017).
  14. Stamenković, S., Dučić, T., Stamenković, V., Kranz, A., Andjus, P. R. Imaging of glial cell morphology, SOD1 distribution and elemental composition in the brainstem and hippocampus of the ALS hSOD1(G93A) rat. Neuroscience. 357, 37-55 (2017).
  15. Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from sera of amyotrophic lateral sclerosis patients induce oxidative stress and upregulation of antioxidative system in BV-2 microglial cell line. Frontiers in Immunology. 8, 1619 (2017).
  16. Boillée, S., Cleveland, D. W. Revisiting oxidative damage in ALS: microglia, Nox, and mutant SOD1. Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 474-478 (2008).
  17. Boillée, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
  18. Martínez-Palma, L., et al. Mitochondrial modulation by dichloroacetate reduces toxicity of aberrant glial cells and gliosis in the SOD1G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of American Society for Experimental Neurotherapeutics. 16 (1), 203-215 (2019).
  19. Díaz-Amarilla, P., et al. Phenotypically aberrant astrocytes that promote motoneuron damage in a model of inherited amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), 18126-18131 (2011).
  20. Barbosa, M., et al. Recovery of depleted miR-146a in ALS cortical astrocytes reverts cell aberrancies and prevents paracrine pathogenicity on microglia and motor neurons. Frontiers in Cell Developmental Biology. 9, 634355 (2021).
  21. Gomes, C., et al. Astrocyte regional diversity in ALS includes distinct aberrant phenotypes with common and causal pathological processes. Experimental Cell Research. 395 (2), 112209 (2020).
  22. Kovacs, M., et al. CD34 identifies a subset of proliferating microglial cells associated with degenerating motor neurons in ALS. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3880 (2019).
  23. Komiya, H., et al. Ablation of interleukin-19 improves motor function in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Molecular Brain. 14 (1), 1-13 (2021).
  24. Trias, E., et al. Emergence of microglia bearing senescence markers during paralysis progression in a rat model of inherited ALS. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 1-14 (2019).
  25. Pullen, A. H., Demestre, M., Howard, R. S., Orrell, R. W. Passive transfer of purified IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis to mice results in degeneration of motor neurons accompanied by Ca2+ enhancement. Acta Neuropatholgica. 107 (1), 35-46 (2004).
  26. Obál, I., et al. Intraperitoneally administered IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis or from an immune-mediated goat model increase the levels of TNF-α, IL-10 in the spinal cord and serum of mice. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 121 (2016).
  27. Obál, I., et al. Experimental motor neuron disease induced in mice with long-term repeated intraperitoneal injections of serum from ALS patients. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2573 (2019).
  28. Mohamed, H. A., et al. Immunoglobulin Fc gamma receptor promotes immunoglobulin uptake, immunoglobulin-mediated calcium increase, and neurotransmitter release in motor neurons. Journal of Neuroscience Research. 69 (1), 110-116 (2002).
  29. Engelhardt, J. I., Siklos, L., Appel, S. H. Altered calcium homeostasis and ultrastructure in motoneurons of mice caused by passively transferred anti-motoneuronal IgG. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 56 (1), 21-39 (1997).
  30. Pagani, M. R., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Calcium signaling pathways mediating synaptic potentiation triggered by amyotrophic lateral sclerosis IgG in motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2661-2672 (2006).
  31. Carter, J. R., Mynlieff, M. Amyotrophic lateral sclerosis patient IgG alters voltage dependence of Ca2+ channels in dissociated rat motoneurons. Neuroscience Letters. 353 (3), 221-225 (2003).
  32. Fratantoni, S. A., Weisz, G., Pardal, A. M., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Amyotrophic lateral sclerosis IgG-treated neuromuscular junctions develop sensitivity to L-type calcium channel blocker. Muscle & Nerve. 23 (4), 543-550 (2000).
  33. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
  34. Vay, S. U., et al. The impact of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) and voltage-gated potassium KCNQ/Kv7 channels on primary microglia function. Journl of Neuroinflammation. 17 (1), 100 (2020).
  35. Bijelić, D. D., et al. Central nervous system-infiltrated immune cells induce calcium increase in astrocytes via astroglial purinergic signaling. Journal of Neuroscience Research. 98 (11), 2317-2332 (2020).
  36. Kawamata, H., et al. Abnormal intracellular calcium signaling and SNARE-dependent exocytosis contributes to SOD1G93A astrocyte-mediated toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2331-2348 (2014).
  37. Nims, R. W., Price, P. J. Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 53 (10), 872-879 (2017).
  38. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
  39. Adzic, M., et al. Extracellular ATP induces graded reactive response of astrocytes and strengthens their antioxidative defense in vitro. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1053-1066 (2017).
  40. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 198 (2020).
  41. Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nature Neuroscince. 17 (1), 131-143 (2014).
  42. Vankriekelsvenne, E., et al. Transmembrane protein 119 is neither a specific nor a reliable marker for microglia. Glia. 70 (6), 1170-1190 (2022).
  43. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).

Play Video

Cite This Article
Milićević, K., Korenić, A., Milošević, M., Andjus, P. R. Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (184), e63483, doi:10.3791/63483 (2022).

View Video