Micro-CT 스캐닝을 활용하여 기생 식물-숙주 상호작용 분석
Summary
Micro-CT는 식물 구조를 3차원으로 분석할 수 있는 비파괴 도구입니다. 현재 프로토콜은 기생 식물 구조 및 기능을 분석하기 위해 마이크로 CT를 활용하기 위한 샘플 준비를 설명합니다. 특정 제제와 결합 될 때이 방법의 장점을 강조하기 위해 다른 종이 사용됩니다.
Abstract
마이크로 CT 스캐닝은 식물의 구조와 기능을 조사하는 데 확립된 도구가 되었습니다. 3차원 시각화 및 가상 절편의 가능성과 결합된 비파괴적 특성으로 인해 복잡한 식물 기관에 대한 새롭고 점점 더 상세한 분석이 가능해졌습니다. 기생 식물과 숙주 사이를 포함하여 식물 간의 상호 작용도 탐구할 수 있습니다. 그러나 스캐닝 전 샘플 준비는 종종 조직 조직과 구성이 다른 이들 식물 간의 상호 작용으로 인해 중요합니다. 또한, 기생충 숙주 물질의 샘플링, 처리 및 준비 중에 고도로 감소된 식물체에서 나무, 허브 및 관목에 이르기까지 기생 꽃 식물의 광범위한 다양성을 고려해야 합니다. 여기에서는 haustorium 분석에 초점을 맞춰 기생충 및/또는 숙주 식물에 대조 용액을 도입하기 위한 두 가지 다른 접근 방식을 설명합니다. 이 기관은 두 식물 사이의 연결과 의사 소통을 촉진합니다. 간단한 접근 방식에 따라 euphytoid, 포도 나무 및 겨우살이 기생 종에 대해 여기에 표시된 것처럼 haustorium 조직 조직의 세부 사항을 3차원으로 탐색할 수 있습니다. 특정 조영제 및 적용 접근법을 선택하면 숙주 체내 기생충 확산을 자세히 관찰하고 여기에 표시된 것처럼 기생충과 숙주 사이의 직접적인 혈관 간 연결을 감지할 수 있습니다. 따라서 여기에서 논의된 프로토콜은 기생 꽃 식물의 광범위한 다양성에 적용하여 발달, 구조 및 기능에 대한 이해를 높일 수 있습니다.
Introduction
고해상도 X선 마이크로컴퓨터 단층촬영(micro-CT)은 샘플의 여러 방사선 사진(투영)을 서로 다른 시야각에서 기록하고나중에 샘플의 가상 재구성을 제공하는 데 사용하는 이미징 방법입니다1. 그런 다음 이 가상 개체를 분석, 조작 및 분할하여 3차원에서 비파괴 탐색이 가능합니다2. 처음에는 의료 분석용으로 설계되었다가 나중에는 산업 응용 분야를 위해 설계된 micro-CT는 침습적 절차 없이 내부 장기와 조직을 시각화할 수 있는 이점도 제공합니다3. 다른 형태의 이미징과 마찬가지로 마이크로 CT는 시야와 픽셀 크기 사이의 균형을 유지하므로 큰 샘플의 고해상도 이미징은 거의 달성할 수 없습니다4. 고 에너지 X 선 소스 (즉, 싱크로트론) 및 2 차 광학 배율 사용의 발전이 지속적으로 이루어지고 있으며, 가장 작은 해상도가 100 nm 5,6 미만에 도달 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 큰 샘플의 경우 더 긴 스캔 시간이 필요하므로 스캐너 내부의 샘플 이동 또는 변형으로 인한 아티팩트 가능성이 높아집니다. 또한 마이크로 CT는 일반적으로 시료 내의 자연 밀도 변화와 시료가 X선과 상호 작용하는 방식에 의해 제한됩니다. 밀도가 높은 시료를 투과하는 데는 X선 선량이 더 많을수록 가장 좋지만, 시료와 주변 매질7 내부 및 그 사이의 밀도 변화를 포착하는 데는 덜 효율적이다. 반면, X선 선량이 낮을수록 투과력이 떨어지고 스캔 시간이 길어지지만 밀도 검출 감도가 더 높아진다7.
이러한 제한은 대부분의 식물 조직이 X선 흡수율이 낮은 빛(비조밀) 조직으로 구성되어 있다는 점을 감안할 때 식물 과학에서 현미경 촬영을 사용하는 데 오랫동안 방해가 되어 왔다8. micro-CT의 첫 번째 응용 프로그램은 토양 매트릭스 9,10 내의 뿌리 네트워크를 매핑하는 데 중점을 두었습니다. 나중에 나무와 같이 조직 밀도에 더 큰 차이가 있는 식물 구조가 탐구되기 시작했습니다. 이를 통해 목부 기능성11,12, 복잡한 조직 조직의 발달 13,14 및 식물 간의 상호 작용15,16,17에 대한 조사가 가능해졌습니다. 연질 및 균질 조직의 분석은 조영제로 인해 널리 보급되고 있으며, 이는 현재 식물 샘플의 마이크로 CT 스캐닝 준비의 표준 절차입니다. 그러나, 조영제 도입을 위한 프로토콜은 시료의 부피, 구조적 특성, 사용된 용액의 종류에 따라 다른 결과를 가질 수 있다8. 이상적으로는, 조영제는 상이한 조직들 사이의 구별을 강화하고, 조직/기관 기능 평가를 가능하게 하고, 및/또는 조직(18)에 대한 생화학적 정보를 제공해야 한다. 따라서 스캔 전 적절한 샘플 처리, 준비 및 장착은 모든 마이크로 CT 분석에 매우 중요합니다.
기생 식물 haustorium의 Micro-CT
기생 꽃 피는 식물은 haustorium으로 알려진 기관을 특징으로 하는 속씨식물의 뚜렷한 작용기를 나타냅니다 19. 변형된 줄기와 뿌리 사이의 발달 잡종인 이 다세포 기관은 숙주의 부착, 침투 및 기생충에 의한 접촉에 작용한다(20). 이러한 이유로 haustorium은 “식물들 사이의 기생에 대한 바로 그 아이디어를 구현”하는 것으로 간주됩니다.21. 이 기관의 발달, 구조 및 기능에 대한 자세한 이해는 기생 식물 생태학, 진화 및 관리 연구에 매우 중요합니다. 그럼에도 불구하고 기생 식물의 전반적인 복잡성과 고도로 변형된 구조 및 하우스토리아는 종종 상세한 분석과 비교를 방해합니다. Haustorium 연결은 또한 일반적으로 광범위하고 조직 및 세포 분포에서 균질하지 않습니다(그림 1). 이러한 맥락에서 작은 조직 조각으로 작업하면 조작이 더 쉽고 해상도가 높아질 수 있지만 기생 식물 haustorium과 같은 복잡한 구조의 3 차원 구조에 대한 잘못된 결론을 이끌어 낼 수 있습니다.
대부분의 기생 식물 종에 대한 하우스 토리움 해부학 및 미세 구조에 대한 방대한 문헌이 있지만, 기생충과 숙주 조직 사이의 3차원 조직과 공간적 관계는 아직 잘 연구되지 않고 있다17. Masumoto et al.22의 최근 연구에서 300개 이상의 직렬 반박형 마이크로톰 섹션이 이미지화되어 두 기생충 종의 하우스토리엄을 나타내는 3차원 가상 개체로 재구성되었습니다. 이 방법의 뛰어난 수준의 디테일은 하우스토리움의 세포 및 해부학적 3D 구조에 대한 전례 없는 통찰력을 제공합니다. 그러나 이러한 시간 소모적 인 기술은보다 광범위한 haustorium 연결을 가진 기생충에서 유사한 분석을 금지합니다. micro-CT의 사용은 기생 식물의 복잡하고 종종 부피가 큰 하우스토리아의 3차원 분석을 위한 훌륭한 도구로 부상합니다. 상세한 해부학적 절편 및 기타 보완적인 형태의 현미경 분석을 대체할 수는 없지만17,23, 특히 큰 샘플에 대한 마이크로 CT 스캐닝을 통해 얻은 결과는 더 작은 세그먼트의 하위 샘플링을 지시하는 가이드 역할을 할 수 있으며, 이는 컨포칼 및 전자 현미경과 같은 다른 도구를 사용하여 분석하거나 고해상도 마이크로 CT 시스템으로 재분석할 수 있습니다.
그림 1: 이 프로토콜에 사용된 다양한 작용기의 기생 식물. Euphytoid 기생충 Pyrularia pubera (A), 녹색 과일 (점선 검은 색 원), 기생 덩굴 Cuscuta americana (C), 겨우살이 Struthanthus martianus (D), 절대 뿌리 기생충 Scybalium fungiforme (E). 숙주 뿌리 (Hr) 또는 줄기 (Hs)의 세그먼트는 기생충 하우스 토륨 (P)에 대비를 적용하는 것을 용이하게합니다. 샘플에 기생충 모근/줄기(화살표)가 있으면 하우스 토리움 혈관 조직을 분석할 수 있습니다. 직사각형은 분석에 사용된 샘플의 세그먼트를 나타냅니다. 스케일 바 = 2cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
micro-CT가 식물 과학에서 점점 더 대중적인 기술이 됨에 따라 샘플 스캐닝, 3차원 재구성, 분할 및 분석을 다루는 가이드, 프로토콜 및 문헌이 있습니다 3,10,24. 따라서 이러한 단계는 여기에서 설명하지 않습니다. 모든 상상 기법과 마찬가지로 샘플의 적절한 처리 및 장착은 종종 간과되는 절차이기는 하지만 기본입니다. 이러한 이유로 이 프로토콜은 마이크로 CT 스캐닝을 위한 하우스 토리움 샘플 준비에 중점을 둡니다. 보다 구체적으로, 이 프로토콜은 호스토리움 샘플에 조영제를 도입하여 호스토리움의 다양한 조직 및 세포 유형의 시각화를 개선하고, 숙주 뿌리/줄기 내의 기생 조직의 검출을 용이하게 하고, 기생충-숙주 혈관 연결을 3차원으로 분석하는 두 가지 접근 방식을 설명합니다. 여기에 설명 된 제제는 다른 식물 구조의 분석에도 적용될 수 있습니다.
여기에 기술된 프로토콜의 편의성을 더 잘 설명하기 위해 5종이 사용되었다. 각 종은 기생 꽃 식물의 5 가지 기능 그룹 중 하나를 나타내므로 각 그룹의 기능과 관련된 특정 사항을 다룹니다. Pyrularia pubera (Santalaceae)는 땅에서 발아하여 기생충을 숙주의 뿌리에 연결하는 여러 haustoria를 형성하는 euphytoid 기생충을 나타 내기 위해 선택되었습니다25. 이러한 식물에 의해 생성된 하우스토리아는 종종 미약하고 숙주(26)(그림 1A)로부터 쉽게 찢어지므로, 보다 섬세한 취급 과정이 필요하다. 내부 기생충은 Viscum minimum (Viscaceae)로 표시됩니다. 이 작용기에 속하는 종들은 짧은 기간 동안 숙주의 몸 밖에서만 볼 수 있으며(그림 1B), 숙주 조직 내에 박혀 있는 현저히 감소된 균사체와 같은 세포 가닥으로 수명 주기의 대부분을 산다25. 세 번째 작용기는 기생 덩굴로 구성되며, 이 덩굴은 땅에서 발아하지만 숙주 식물의 줄기에 부착되는 여러 하우스토리아에 의존하여 기초적인 뿌리만 형성합니다25(그림 1C). 여기서, 이 작용기는 Convolvulaceae(Convolvulaceae)로 대표된다. 기생 덩굴과는 달리, 겨우살이는 숙주 식물의 가지에서 직접 발아하여 여러 개 또는 고독한 하우스토리아를 발달시킨다25. 이 작용기를 설명하기 위해 선택된 종은 Struthanthus martianus (Loranthaceae)로, 숙주 가지와 다양한 연결을 형성합니다 (그림 1D). micro-CT와 광학 현미경의 조합을 이용한 고독한 겨우살이 하우스토리아의 분석은 Teixeira-Costa & Ceccantini17에서 찾을 수 있습니다. 마지막으로, 절대 뿌리 기생충은 땅에서 발아하여 숙주 식물의 뿌리에 침투하는 종으로 구성되며, 초기 성장 단계부터 전적으로 의존한다25. 이 식물은 여기에서 Scybalium fungiforme (Balanophoraceae)으로 대표되며, 이는 큰 괴경과 같은 haustoria를 생산합니다 (그림 1E).
이 프로토콜에 사용된 모든 식물 샘플을 70% 포르말린 아세트산 알코올(FAA 70)에 고정했습니다. 샘플링 시 고정은 특히 후속 해부학적 분석이 필요한 경우 식물 조직을 보존하는 데 중요합니다. 기생 식물 haustorium의 경우, 이 기관은 종종 주로 목질화되지 않은 실질 세포로 구성되기 때문에 고정도 필수적이다20. 고정액의 제조를 포함하여, 식물 조직 고정을 위한 상세한 프로토콜은 다른 곳에서 찾을 수 있다27. 반면에, 어느 정도 고정제는 샘플의 물리적 및 화학적 특성을 변화시켜 특정 생체역학적 및 조직화학적 분석에 적합하지 않게 만들 수 있습니다. 따라서, 신선한 샘플, 즉 준비 직전에 수집된 고정되지 않은 물질도 이 프로토콜과 함께 사용할 수 있습니다. 새로운 샘플을 처리하는 방법과 고정된 재료에 대한 문제 해결 제안에 대한 자세한 내용은 토론 섹션에 제공됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
식물 조직 대비를 개선하기 위해 중금속 용액을 사용하는 것은 마이크로 CT 분석을 위한 샘플 준비에서 중요한 단계가 되었습니다. Staedler et al.은 식물 미세 형태학 실험실에서 일반적으로 사용할 수있는 몇 가지 화합물을 테스트했으며, 샘플을 관통하고 대비 지수를 높이는 데 가장 효과적인 약제로 포스 포 텅스텐 산염을 사용할 것을 권장합니다8. P. pubera 의 하우스 토리…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
다양한 현미경 촬영 시스템 및 데이터 분석 소프트웨어에 대한 최고의 도움과 필수 사용자 교육을 제공한 Simone Gomes Ferreira 박사(브라질 상파울루 대학교 현미경 촬영 실험실)와 Greg Lin 박사(미국 하버드 대학교 나노스케일 시스템 센터)에게 감사드립니다. 또한 미국 코네티컷 대학의 EEB 온실 직원, 특히 최소 비스쿰 표본을 제공한 클린턴 모스와 매튜 오펠에게도 감사드립니다. John Wenzel 박사는 Pyrularia pubera의 샘플링에 대한 기회와 큰 도움을 제공했습니다. 석사 Carolina Bastos, 석사 Yasmin Hirao 및 Talitha Motta는 Scybalium fungiforme의 샘플링에 큰 도움을 주었습니다. 석사 Ariadne Furtado, Drs. Fernanda Oliveira와 Maria Aline Neves는 내생 균류 분석을 위한 플록신 B의 사용에 대한 참고 자료를 제공했습니다. Vrije Universiteit Brussel의 비디오 녹화는 Philippe Claeys 박사, Christophe Snoeck 박사, Jake Griffith 박사, Barabara Veselka 박사 및 Harry Olde Venterink 박사의 도움으로 가능했습니다. 자금은 고등 교육 인력 개선을 위한 조정(CAPES, 브라질)과 Harvard University Herbaria(미국)에서 제공했습니다.
Materials
| 3D X-ray microscope (XRM) system | Zeiss Versa 620 | used to scan Pyrularia pubera | |
| 3D X-ray microscope + A2:D22 | Zeiss | Versa 620 | Used for scanning the species P. pubera |
| CT-Pro 3D software | Nikon | version XT 3.1.11 | Used for three-dimensional reconstruction of scans |
| CT-Vox software | Bruker | version 3.3.1 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Dragonfly software | Object Research Systems – ORS | version | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Glass vials | Glass Vials Inc. SE | V2708C-FM-SP | Sold by VWR – USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi |
| Inspect-X | Zeiss | version XT 3.1.11 | Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system |
| Iodine solution 0.0282 N | WR Chemicals BDH | BDH7422-1 | Sold by VWR – USA |
| Lead Nitrate II PA 500 g | Vetec | 361.08 | Sold by SPLab |
| Microtomography scanner | Bruker | Skyscan1176 | Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme |
| Microtomography scanner | Nikon | X-Tek HMXST225 | Used for scanning the species V. minimum |
| NRecon software | Bruker | version 1.0.0 | Used for three-dimensional reconstruction |
| Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 101410-756 | Sold by VWR – USA |
| Plastic film (Parafilm) | Heathrow Scientific | PM996 | Sold by VWR – USA |
| Plastic IV bag 500 mL | Taylor | 3478 | Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude |
| PVC tubing 3/4'' | Nalge Nunc International | SC63013-164 | Sold by VWR – USA |
| Scanning system | Nikon X-Tek HMXST225 | used to scan Viscum minimum | |
| Scanning system | Bruker Skyscan 1176 | used to scan C. americana | |
| Scout-and-ScanTM software | Zeiss | version 16 | Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans |
| Three-way valve | ToToT | DMTWVS-5 | Sold by Amazon USA |
| Two-part syringe | HSW Henke-Ject | 4850001000 | Used without the plunger |
| Vacuum chamber | Binder | 80080-434 | Sold by VWR – USA; includes pump and connecting tubes |
| VG Studio Max software | Volume Graphics | version 3.0 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
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