الاستفادة من التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لتحليل التفاعلات الطفيلية بين النبات والمضيف
Summary
Micro-CT هي أداة غير مدمرة يمكنها تحليل الهياكل النباتية في ثلاثة أبعاد. يصف هذا البروتوكول تحضير العينة للاستفادة من التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لتحليل بنية النبات الطفيلي ووظيفته. يتم استخدام أنواع مختلفة لتسليط الضوء على مزايا هذه الطريقة عندما تقترن باستعدادات محددة.
Abstract
أصبح التصوير المقطعي المحوسب الدقيق أداة راسخة في التحقيق في بنية النبات ووظيفته. سمحت طبيعتها غير المدمرة ، جنبا إلى جنب مع إمكانية التصور ثلاثي الأبعاد والتقسيم الافتراضي ، بتحليل جديد ومفصل بشكل متزايد للأعضاء النباتية المعقدة. يمكن أيضا استكشاف التفاعلات بين النباتات ، بما في ذلك بين النباتات الطفيلية ومضيفيها. ومع ذلك ، يصبح تحضير العينة قبل المسح أمرا بالغ الأهمية بسبب التفاعل بين هذه النباتات ، والتي غالبا ما تختلف في تنظيم الأنسجة وتكوينها. علاوة على ذلك ، يجب مراعاة التنوع الواسع للنباتات المزهرة الطفيلية ، بدءا من الأجسام النباتية شديدة الانخفاض إلى الأشجار والأعشاب والشجيرات ، أثناء أخذ العينات ومعالجتها وتحضير المواد المضيفة للطفيليات. هنا يتم وصف نهجين مختلفين لإدخال حلول التباين في الطفيلي و / أو النباتات المضيفة ، مع التركيز على تحليل haustorium. يعزز هذا العضو الاتصال والتواصل بين النباتين. باتباع نهج بسيط ، يمكن استكشاف تفاصيل تنظيم أنسجة haustorium ثلاثية الأبعاد ، كما هو موضح هنا للأنواع الطفيلية euphytoid والكرمة والهدال. كما يسمح اختيار عوامل التباين المحددة ونهج التطبيق بمراقبة مفصلة لانتشار الطفيليات الداخلية داخل الجسم المضيف والكشف عن الاتصال المباشر من سفينة إلى أخرى بين الطفيلي والمضيف ، كما هو موضح هنا لطفيلي جذر ملزم. وبالتالي ، يمكن تطبيق البروتوكول الذي تمت مناقشته هنا على التنوع الواسع للنباتات المزهرة الطفيلية لتعزيز فهم تطورها وهيكلها وعملها.
Introduction
التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية عالي الدقة (micro-CT) هو طريقة تصوير يتم فيها تسجيل صور شعاعية متعددة (إسقاطات) لعينة من زوايا مشاهدة مختلفة وتستخدم لاحقا لتوفير إعادة بناء افتراضية للعينة1. يمكن بعد ذلك تحليل هذا الكائن الافتراضي ومعالجته وتجزئته ، مما يسمح بالاستكشاف غير المدمر في ثلاثة أبعاد2. تم تصميم التصوير المقطعي المحوسب الدقيق في البداية للتحليلات الطبية وبعد ذلك للتطبيقات الصناعية ، كما يوفر ميزة تصور الأعضاء والأنسجة الداخلية دون الحاجة إلى إجراءات جراحية3. مثل أشكال التصوير الأخرى ، يعمل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق مع المفاضلة بين مجال الرؤية وحجم البكسل ، مما يعني أن التصوير عالي الدقة للعينات الكبيرة يكاد يكون بعيد المنال4. يتم باستمرار إحراز تقدم في استخدام مصادر الأشعة السينية عالية الطاقة (أي السنكروترون) والتكبير البصري الثانوي ، مما يسمح لأصغر دقة بالوصول إلى أقل من 100 نانومتر 5,6. ومع ذلك ، فإن أوقات المسح الأطول ضرورية للعينات الكبيرة ، مما يزيد من فرصة القطع الأثرية بسبب حركة العينة أو تشوهها داخل الماسح الضوئي. علاوة على ذلك ، فإن التصوير المقطعي المحوسب الدقيق محدود بشكل عام بسبب اختلافات الكثافة الطبيعية داخل العينة وكيفية تفاعل العينة مع الأشعة السينية. في حين أن جرعة الأشعة السينية الأعلى هي الأفضل لاختراق العينات الأكثر كثافة ، إلا أنها أقل كفاءة في التقاط الاختلافات في الكثافة داخل العينة وبين الوسط المحيط بها7. من ناحية أخرى ، توفر جرعة الأشعة السينية المنخفضة قوة اختراق أقل وغالبا ما تتطلب أوقات مسح أطول ولكن حساسية أكبر في اكتشاف الكثافة7.
لطالما أعاقت هذه القيود استخدام التصوير المقطعي المجهري لعلوم النبات ، بالنظر إلى أن معظم الأنسجة النباتية تتكون من أنسجة خفيفة (غير كثيفة) ذات امتصاص منخفض للأشعة السينية8. ركزت التطبيقات الأولى للتصوير المقطعي المحوسب الدقيق على رسم خرائط لشبكات الجذر داخل مصفوفة التربة 9,10. في وقت لاحق ، بدأ استكشاف الهياكل النباتية ذات الاختلافات الأكثر أهمية في كثافة الأنسجة ، مثل الخشب. وقد سمح ذلك بفحص وظائف نسيج الخشب 11،12 ، وتطوير منظمات الأنسجة المعقدة 13،14 ، والتفاعلات بين النباتات15،16،17. أصبح تحليل الأنسجة الرخوة والمتجانسة واسع الانتشار بسبب عوامل التباين ، والتي أصبحت الآن إجراء قياسيا في الاستعدادات للمسح المقطعي المحوسب الدقيق لعينات النبات. ومع ذلك ، يمكن أن يكون لبروتوكولات إدخال التباين نتائج مختلفة اعتمادا على حجم العينة والخصائص الهيكلية ونوع الحل المستخدم8. من الناحية المثالية ، يجب أن يعزز عامل التباين التمييز بين الأنسجة المختلفة ، وتمكين تقييم وظائف الأنسجة / الأعضاء ، و / أو توفير معلومات كيميائية حيوية حول الأنسجة18. لذلك ، تصبح معالجة العينات المناسبة وإعدادها وتركيبها قبل المسح أمرا بالغ الأهمية لأي تحليل مقطعي محوسب دقيق.
Micro-CT من haustorium النبات الطفيلي
تمثل النباتات المزهرة الطفيلية مجموعة وظيفية متميزة من كاسيات البذور تتميز بعضو يعرف باسم haustorium19. يعمل هذا العضو متعدد الخلايا ، وهو هجين تنموي بين جذع معدل وجذر ، على ارتباط المضيف واختراقه واتصاله بواسطة طفيلي20. لهذا السبب ، يعتبر haustorium “يجسد فكرة التطفل بين النباتات”21. يعد الفهم التفصيلي لتطور هذا العضو وهيكله وعمله أمرا بالغ الأهمية لعلم البيئة النباتية الطفيلية والتطور ودراسات الإدارة. ومع ذلك ، فإن التعقيد العام للنباتات الطفيلية والبنية المعدلة للغاية و haustoria غالبا ما يعيقان التحليل التفصيلي والمقارنة. عادة ما تكون وصلات Haustorium واسعة النطاق وغير متجانسة في توزيع الأنسجة والخلايا (الشكل 1). في هذا السياق ، في حين أن العمل مع شظايا الأنسجة الصغيرة يسمح بمعالجة أسهل ودقة أعلى ، يمكن أن يؤدي إلى استنتاجات خاطئة حول البنية ثلاثية الأبعاد للهياكل المعقدة ، مثل نبات haustorium الطفيلي.
على الرغم من وجود أدبيات واسعة حول تشريح haustorium والبنية التحتية لمعظم أنواع النباتات الطفيلية ، إلا أن التنظيم ثلاثي الأبعاد والعلاقة المكانية بين أنسجة الطفيليات والمضيف لا تزال غير مستكشفةبشكل جيد 17. في عمل حديث قام به Masumoto et al.22 ، تم تصوير أكثر من 300 مقطع ميكروتومي شبه رقيق متسلسل وإعادة بنائه في كائن افتراضي ثلاثي الأبعاد يمثل haustorium لنوعين من الطفيليات. يوفر المستوى الممتاز من التفاصيل لهذه الطريقة رؤى غير مسبوقة في بنية 3-D الخلوية والتشريحية في haustorium. ومع ذلك ، فإن مثل هذه التقنية التي تستغرق وقتا طويلا ستمنع إجراء تحليل مماثل في الطفيليات ذات وصلات haustorium أكثر شمولا. يظهر استخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق كأداة ممتازة للتحليل ثلاثي الأبعاد للنباتات الطفيلية المعقدة والضخمة في كثير من الأحيان. على الرغم من أنها ليست بديلا عن التقسيم التشريحي التفصيلي والأشكال التكميلية الأخرى لتحليلات الفحص المجهري17,23 ، إلا أن النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، خاصة بالنسبة للعينات الكبيرة ، يمكن أيضا أن تكون بمثابة دليل لتوجيه أخذ العينات الفرعية للأجزاء الأصغر ، والتي يمكن تحليلها بعد ذلك باستخدام أدوات أخرى ، مثل المجهر البؤري والإلكتروني ، أو إعادة تحليلها باستخدام أنظمة التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة عالية الدقة.
الشكل 1: النباتات الطفيلية ذات المجموعات الوظيفية المختلفة المستخدمة في هذا البروتوكول. الطفيلي Euphytoid Pyrularia pubera (A) ، الطفيلي الداخلي Viscum الحد الأدنى (B) مع الفواكه الخضراء (دائرة سوداء متقطعة) ، الكرمة الطفيلية Cuscuta americana (C) ، الهدال Struthanthus martianus (D) ، يلزم طفيلي الجذر Scybalium fungiforme (E). تسهل أجزاء الجذر المضيف (Hr) أو الساق (Hs) تطبيق التباين في الطفيلي haustorium (P). يسمح وجود جذر / ساق الأم الطفيلية (الأسهم) في العينة بتحليل تنظيم وعاء haustorium. تشير المستطيلات إلى أجزاء من العينة المستخدمة للتحليل. أشرطة المقياس = 2 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
نظرا لأن التصوير المقطعي المحوسب الدقيق أصبح تقنية شائعة بشكل متزايد في علوم النبات ، فهناك أدلة وبروتوكولات وأدبيات تتعامل مع مسح العينات وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد والتجزئة والتحليل3،10،24. وبالتالي ، لن تتم مناقشة هذه الخطوات هنا. كما هو الحال مع أي تقنية تخيل ، يعد العلاج المناسب وتركيب العينات أمرا أساسيا ، وإن كان غالبا ما يتم تجاهله. لهذا السبب ، يركز هذا البروتوكول على إعداد عينات haustorium للمسح المقطعي المحوسب الدقيق. وبشكل أكثر تحديدا ، يصف هذا البروتوكول طريقتين لإدخال عوامل التباين في عينات haustorium لتحسين تصور الأنسجة وأنواع الخلايا المختلفة في haustorium ، لتسهيل الكشف عن الأنسجة الطفيلية داخل جذر / ساق المضيف ، وتحليل الروابط الوعائية بين الطفيلي والمضيف في ثلاثة أبعاد. يمكن أيضا تكييف المستحضرات الموصوفة هنا مع تحليل الهياكل النباتية الأخرى.
تم استخدام خمسة أنواع لتوضيح راحة البروتوكول الموصوف هنا بشكل أفضل. يمثل كل نوع واحدة من المجموعات الوظيفية الخمس للنباتات المزهرة الطفيلية ، وبالتالي يعالج نقاطا محددة تتعلق بوظيفة كل مجموعة. تم اختيار Pyrularia pubera (Santalaceae) لتمثيل الطفيليات euphytoid ، التي تنبت في الأرض وتشكل العديد من haustoria التي تربط الطفيلي بجذور مضيفيه25. غالبا ما تكون الهوستريا التي أنشأتها هذه النباتات ضعيفة ويمكن تمزيقها بسهولة عن المضيف26 (الشكل 1 أ) ، مما يتطلب عملية معالجة أكثر دقة. يتم تمثيل الطفيليات الداخلية هنا بواسطة الحد الأدنى من اللزوجة (Viscaceae). لا يمكن رؤية الأنواع في هذه المجموعة الوظيفية إلا خارج جسم مضيفيها لفترات قصيرة (الشكل 1 ب) وتعيش معظم دورات حياتها كخيوط خلايا مختزلة بشكل كبير وشبيهة بالفطريات مدمجة داخل أنسجة المضيف25. تتكون المجموعة الوظيفية الثالثة من الكروم الطفيلية ، التي تنبت على الأرض ولكنها تشكل جذورا بدائية فقط ، وتعتمد على العديد من haustoria التي ترتبط بسيقان النباتات المضيفة25 (الشكل 1C). هنا ، يتم تمثيل هذه المجموعة الوظيفية بواسطة Cuscuta americana (Convolvulaceae). على عكس الكروم الطفيلية ، ينبت الهدال مباشرة على أغصان النباتات المضيفة ويتطور إما هاوستريا متعددة أو انفرادية25. الأنواع المختارة لتوضيح هذه المجموعة الوظيفية هي Struthanthus martianus (Loranthaceae) ، والتي تشكل روابط مختلفة مع الفرع المضيف (الشكل 1D). يمكن العثور على تحليل الهدال الانفرادي باستخدام مزيج من التصوير المقطعي المحوسب الدقيق والمجهر الضوئي في Teixeira-Costa و Ceccantini17. أخيرا ، تشتمل طفيليات الجذور الملزمة على الأنواع التي تنبت على الأرض وتخترق جذور النباتات المضيفة ، والتي تعتمد عليها كليا منذ مراحل النمو المبكرة25. يتم تمثيل هذه النباتات هنا بواسطة Scybalium fungiforme (Balanophoraceae) ، والتي تنتج هاوستوريا كبيرة تشبه الدرنات (الشكل 1E).
تم تثبيت جميع العينات النباتية المستخدمة في هذا البروتوكول في كحول حمض الخليك الفورمالين بنسبة 70٪ (FAA 70). يعد التثبيت عند أخذ العينات أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على الأنسجة النباتية ، خاصة إذا كانت هناك حاجة إلى تحليلات تشريحية لاحقة. في حالة نبات haustorium الطفيلي ، يكون التثبيت ضروريا أيضا ، لأن هذا العضو غالبا ما يتكون بشكل أساسي من خلايا الحمة غير الخشنة20. يمكن العثور على بروتوكولات مفصلة لتثبيت الأنسجة النباتية ، بما في ذلك إعداد المحاليل المثبتة ، في مكان آخر27. من ناحية أخرى ، بدرجة أكبر أو أقل ، يمكن أن تسبب المثبتات تغيرات في الخصائص الفيزيائية والكيميائية للعينة ، مما يجعلها غير مناسبة لتحليلات ميكانيكية حيوية وكيميائية محددة. وبالتالي ، يمكن أيضا استخدام عينات جديدة ، أي المواد غير المثبتة التي تم جمعها مباشرة قبل التحضير ، مع هذا البروتوكول. يتم توفير تفاصيل حول كيفية التعامل مع العينات الجديدة واقتراحات استكشاف الأخطاء وإصلاحها للمواد المثبتة في قسم المناقشة.
Protocol
Representative Results
Discussion
أصبح استخدام محاليل المعادن الثقيلة لتحسين تباين الأنسجة النباتية خطوة حاسمة في تحضير العينات لتحليل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق. تم اختبار العديد من المركبات المتوفرة بشكل شائع في مختبرات التشكل الدقيق للنبات من قبل Staedler et al. ، الذين يوصون باستخدام phosphotungstate كعامل أكثر فعالية في اختر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أود أن أشكر الدكتور سيمون غوميز فيريرا (مختبر التصوير المقطعي المجهري ، جامعة ساو باولو ، البرازيل) والدكتور جريج لين (مركز أنظمة النانو ، جامعة هارفارد ، الولايات المتحدة الأمريكية) على مساعدتهم القصوى وتدريب المستخدم الذي لا غنى عنه لأنظمة التصوير المقطعي المجهري المختلفة وبرامج تحليل البيانات. كما أشكر الموظفين في EEB Greenhouse في جامعة كونيتيكت (الولايات المتحدة الأمريكية) ، وخاصة كلينتون مورس وماثيو أوبل لتوفير عينات من الحد الأدنى من Viscum. قدم الدكتور جون وينزل الفرصة والمساعدة الكبيرة لأخذ عينات من Pyrularia pubera. ماجستير كارولينا باستوس ، ماجستير ياسمين هيراو ، وطاليثا موتا ساعدت بشكل كبير في أخذ عينات من فطريات Scybalium. قدم ماجستير أريادن فورتادو والدكتور فرناندا أوليفيرا وماريا ألين نيفيس المرجع لاستخدام الفلوكسين ب لتحليل الفطريات الداخلية. أصبح تسجيل الفيديو في جامعة بروكسل الحرة ممكنا بمساعدة الدكتور فيليب كلايس والدكتور كريستوف سنويك وماجستير جيك جريفيث والدكتور بارابارا فيسيلكا والدكتور هاري أولد فينترينك. تم توفير التمويل من قبل هيئة التنسيق لتحسين موظفي التعليم العالي (CAPES ، البرازيل) وجامعة هارفارد هيرباريا (الولايات المتحدة الأمريكية).
Materials
| 3D X-ray microscope (XRM) system | Zeiss Versa 620 | used to scan Pyrularia pubera | |
| 3D X-ray microscope + A2:D22 | Zeiss | Versa 620 | Used for scanning the species P. pubera |
| CT-Pro 3D software | Nikon | version XT 3.1.11 | Used for three-dimensional reconstruction of scans |
| CT-Vox software | Bruker | version 3.3.1 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Dragonfly software | Object Research Systems – ORS | version | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Glass vials | Glass Vials Inc. SE | V2708C-FM-SP | Sold by VWR – USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi |
| Inspect-X | Zeiss | version XT 3.1.11 | Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system |
| Iodine solution 0.0282 N | WR Chemicals BDH | BDH7422-1 | Sold by VWR – USA |
| Lead Nitrate II PA 500 g | Vetec | 361.08 | Sold by SPLab |
| Microtomography scanner | Bruker | Skyscan1176 | Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme |
| Microtomography scanner | Nikon | X-Tek HMXST225 | Used for scanning the species V. minimum |
| NRecon software | Bruker | version 1.0.0 | Used for three-dimensional reconstruction |
| Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 101410-756 | Sold by VWR – USA |
| Plastic film (Parafilm) | Heathrow Scientific | PM996 | Sold by VWR – USA |
| Plastic IV bag 500 mL | Taylor | 3478 | Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude |
| PVC tubing 3/4'' | Nalge Nunc International | SC63013-164 | Sold by VWR – USA |
| Scanning system | Nikon X-Tek HMXST225 | used to scan Viscum minimum | |
| Scanning system | Bruker Skyscan 1176 | used to scan C. americana | |
| Scout-and-ScanTM software | Zeiss | version 16 | Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans |
| Three-way valve | ToToT | DMTWVS-5 | Sold by Amazon USA |
| Two-part syringe | HSW Henke-Ject | 4850001000 | Used without the plunger |
| Vacuum chamber | Binder | 80080-434 | Sold by VWR – USA; includes pump and connecting tubes |
| VG Studio Max software | Volume Graphics | version 3.0 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
References
- Stock, S. R. . Microcomputed tomography: Methodology and applications. , (2020).
- Hounsfield, G. N. Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system. British Journal of Radiology. 46 (552), 1016-1022 (1973).
- Dutilleul, P., Lafond, J. A. Editorial: Branching and rooting out with a CT Scanner: The why, the how, and the outcomes, present and possibly future pierre. Frontiers in Plant Science. 7 (41), 5-6 (2016).
- Metscher, B. D. Biological applications of X-ray microtomography: Imaging micro- anatomy, molecular expression and organismal diversity. Microscopy and Analysis. 27 (2), 13-16 (2013).
- Sakdinawat, A., Attwood, D. Nanoscale X-ray imaging. Nature Photonics. 4 (12), 840-848 (2010).
- Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano-tomography. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
- Lafond, J. A., Han, L., Dutilleul, P. Concepts and analyses in the ct scanning of root systems and leaf canopies: A timely summary. Frontiers in Plant Science. 6 (1111), 85-91 (2015).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via X-Ray Tomography: Simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS ONE. 8 (9), 75295 (2013).
- Heeraman, D. A., Hopmans, J. W., Clausnitzer, V. Three dimensional imaging of plant roots in situ with X-ray Computed Tomography. Plant and Soil. 189, 167-179 (1997).
- Dhondt, S., Vanhaeren, H., Van Loo, D., Cnudde, V., Inzé, D. Plant structure visualization by high-resolution X-ray computed tomography. Trends in Plant Science. 15 (8), 419-422 (2010).
- McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
- Cochard, H., Delzon, S., Badel, E. X-ray microtomography (micro-CT): A reference technology for high-resolution quantification of xylem embolism in trees. Plant, Cell and Environment. 38 (1), 201-206 (2015).
- Bastos, C. L., Tamaio, N., Angyalossy, V. Unravelling roots of lianas: A case study in Sapindaceae. Annals of Botany. 118 (4), 733-746 (2016).
- da Cunha Neto, I. L., et al. Diversity, distribution, development, and evolution of medullary bundles in Nyctaginaceae. American Journal of Botany. 107 (5), 707-725 (2020).
- Milien, M., Renault-Spilmont, A. S., Cookson, S. J., Sarrazin, A., Verdeil, J. L. Visualization of the 3D structure of the graft union of grapevine using X-ray tomography. Scientia Horticulturae. 144, 130-140 (2012).
- Paya, A. M., Silverberg, J. L., Padgett, J., Bauerle, T. L. X-ray computed tomography uncovers root-root interactions: Quantifying spatial relationships between interacting root systems in three dimensions. Frontiers in Plant Science. 6 (274), 54-65 (2015).
- Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. C. T. Aligning microtomography analysis with traditional anatomy for a 3D understanding of the host-parasite interface – Phoradendron spp. Case study. Frontiers in Plant Science. 7, 1340 (2016).
- Lusic, H., Grinstaff, M. W. X-ray-computed tomography contrast agents. Chemical Reviews. 113 (3), 1641-1666 (2013).
- Těšitel, J. Functional biology of parasitic plants: a review. Plant Ecology and Evolution. 149 (1), 5-20 (2016).
- Teixeira-Costa, L. A living bridge between two enemies: Haustorium structure and evolution across parasitic flowering plants. Revista Brasileira de Botanica. 44 (1), 165-178 (2021).
- Kuijt, J. . The Biology of Parasitic Flowering Plants. , (1969).
- Masumoto, N., et al. Three-dimensional reconstructions of haustoria in two parasitic plant species in the Orobanchaceae. Plant Physiology. 185 (4), 1429-1442 (2021).
- Calo, C. M., et al. A correlation analysis of Light Microscopy and X-ray MicroCT imaging methods applied to archaeological plant remains’ morphological attributes visualization. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
- Brodersen, C. R., Roddy, A. B. New frontiers in the three-dimensional visualization of plant structure and function. American Journal of Botany. 103 (2), 184-188 (2016).
- Teixeira-Costa, L., Davis, C. C. Life history, diversity, and distribution in parasitic flowering plants. Plant Physiology. 187 (1), 32-51 (2021).
- Simpson, B. B. Krameriaceae. Flora Neotropica Monograph. 49, (1989).
- Ruzin, S. E. . Plant microtechnique and microscopy. , (1999).
- Nikolov, L. A., Tomlinson, P. B., Manickam, S., Endress, P. K., Kramer, E. M., Davis, C. C. Holoparasitic Rafflesiaceae possess the most reduced endophytes and yet give rise to the world’s largest flowers. Annals of Botany. 114, 233-242 (2014).
- Thorogood, C. J., Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G., Davis, C., Hiscock, S. J. Endoparasitic plants and fungi show evolutionary convergence across phylogenetic divisions. New Phytologist. 232 (3), 1159-1167 (2021).
- Largent, D., Johnson, D., Watling, R. . How to Identify Mushrooms to Genus III: Microscopic Features. , (1977).
- Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
- Sperry, J. S., Donnelly, J. R., Tyree, M. T. A method for measuring hydraulic conductivity and embolism in xylem. Plant, Cell and Environment. 11, 35-40 (1988).
- Calvin, C. L. Host-formed tyloses in vessels of the mistletoe Phoradendron (Viscaceae). IAWA Journal. 18 (2), 117-126 (1997).
- Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. Embolism increase and anatomical modifications caused by a parasitic plant. IAWA Journal. 36 (2), 138-151 (2015).
- Ellmore, G. S., Ewers, F. W. Fluid flow in the outermost xylem increment of a ring-porous tree, Ulmus americana. American Journal of Botany. 73 (12), 1771-1774 (1986).
- Ellis, E. A. Staining sectioned biological specimens for transmission electron microscopy: Conventional and En bloc stains. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117, 57-72 (2014).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: In vivo visualizations using high-resolution computed tomography. Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
- Brodersen, C. R., et al. Automated analysis of three-dimensional xylem networks using high-resolution computed tomography. New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
- Lee, K., et al. Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18 (9), 2145-2156 (2006).
