利用显微CT扫描分析寄生植物与宿主的相互作用
Summary
显微CT是一种非破坏性工具，可以从三个维度上分析植物结构。本协议描述了利用micro-CT分析寄生植物结构和功能的样品制备。当与特定制剂结合使用时，使用不同的物种来突出该方法的优点。
Abstract
显微CT扫描已成为研究植物结构和功能的成熟工具。它的非破坏性，加上三维可视化和虚拟切片的可能性，使得对复杂的植物器官进行新颖且越来越详细的分析成为可能。植物之间的相互作用，包括寄生植物与其宿主之间的相互作用，也可以探索。然而，由于这些植物之间的相互作用，扫描前的样品制备变得至关重要，这些植物的组织组织和组成通常不同。此外，在寄生虫宿主材料的取样、处理和制备过程中，必须考虑寄生开花植物的广泛多样性，从高度减少的营养体到树木、草药和灌木。这里描述了将造影剂引入寄生虫和/或寄主植物的两种不同方法，重点是分析造影剂。该器官促进了两种植物之间的联系和交流。遵循简单的方法，可以三维探索Haustorium组织组织的细节，如此处所示的真生，藤本和槲寄生寄生物种。选择特定的造影剂和应用方法还可以详细观察寄生虫在宿主体内的传播，并检测寄生虫和宿主之间的直接血管到血管连接，如此处所示的专性根寄生虫。因此，这里讨论的协议可以应用于寄生开花植物的广泛多样性，以促进对其发育、结构和功能的理解。
Introduction
高分辨率 X 射线显微计算机断层扫描 （micro-CT） 是一种成像方法，其中从不同的视角记录样品的多张 X 光片（投影），然后用于提供样品的虚拟重建1。然后可以对该虚拟对象进行分析、操作和分割，从而实现三维非破坏性探索2.micro-CT最初设计用于医学分析，后来用于工业应用，还具有可视化内部器官和组织的优势，而无需侵入性程序3。与其他形式的成像一样，显微CT在视场和像素大小之间进行权衡，这意味着大样本的高分辨率成像几乎无法实现4。使用高能X射线源（即同步加速器）和二次光学放大倍率方面不断取得进展，使最小分辨率达到100 nm5，6以下。然而，对于大样品，需要更长的扫描时间，从而增加由于样品移动或扫描仪内部变形而导致伪影的机会。此外，显微CT通常受到样品内自然密度变化以及样品与X射线相互作用的限制。虽然较高的X射线剂量最适合穿透密度较大的样品，但它在捕获样品与其周围介质之间密度变化的效率较低7。另一方面，较低的X射线剂量提供较少的穿透力，并且通常需要更长的扫描时间，但在密度检测中需要更高的灵敏度7。
这些限制长期以来一直阻碍了显微断层扫描在植物科学中的应用，因为大多数植物组织由具有低X射线吸收的光（非致密）组织组成8。micro-CT的最初应用集中在绘制土壤基质9，10内的根网络。后来，开始探索组织密度差异更显着的植物结构，例如木材。这使得能够研究木质部功能11，12，复杂组织的发展13，14以及植物之间的相互作用15，16，17。由于造影剂的使用，软组织和均匀组织的分析正变得越来越普遍，造影剂现在是植物样品显微CT扫描准备的标准程序。然而，造影剂引入方案可能会有不同的结果，具体取决于样品体积、结构特性和所用溶液的类型8。理想情况下，造影剂应增强不同组织之间的区别，能够评估组织/器官功能，和/或提供有关组织的生化信息18。因此，扫描前充分的样品处理、制备和镶嵌对于任何显微CT分析都至关重要。
寄生植物的显微CT检查
寄生开花植物代表被子植物的一个独特的功能群，其特征在于称为 haustorium19的器官。这种多细胞器官是改良茎和根之间的发育杂交体，作用于宿主的附着、渗透和寄生虫的接触20。出于这个原因，haustorium被认为“体现了植物之间寄生的想法”21。详细了解该器官的发育、结构和功能对于寄生植物生态学、进化和管理研究至关重要。然而，寄生植物的整体复杂性和高度改变的结构和房屋往往阻碍了详细的分析和比较。Haustorium连接通常也很广泛，并且在组织和细胞分布上不均匀（图1）。在这种情况下，虽然处理小组织碎片可以更容易地操作和更高的分辨率，但它可能导致关于复杂结构的三维结构的错误结论，例如寄生植物haustorium。
尽管有大量关于寄生植物物种的Haustorium解剖学和超微结构的文献，但寄生虫和宿主组织之间的三维组织和空间关系仍然没有得到充分探索17。在Masumoto等人最近的一项工作中，22将300多个连续半薄切片机切片成像并重建为代表两种寄生虫物种的三维虚拟物体。这种方法出色的细节水平为Haustorium的细胞和解剖学3D结构提供了前所未有的洞察力。然而，这种耗时的技术将禁止在具有更广泛Haustorium连接的寄生虫中进行类似的分析。显微CT的使用成为对寄生植物的复杂且通常笨重的Haustoria进行三维分析的绝佳工具。虽然不能替代详细的解剖切片和其他补充形式的显微镜分析17，23，但通过显微CT扫描获得的结果，特别是对于大样本，也可以作为指导较小片段的子采样的指南，然后可以使用其他工具进行分析，例如共聚焦和电子显微镜，或使用高分辨率显微CT系统重新分析。
图1：本协议中使用的不同功能组的寄生植物。真生寄生虫耻骨胫螨（A），内寄生虫内脏最小（B），绿色果实（黑色虚线圆圈），寄生藤美洲槲寄生（C），槲寄生Struthanthus martianus（D），专性根寄生虫Scybalium fungiforme（E）。宿主根（Hr）或茎（Hs）的片段有助于将造影剂应用于寄生虫Haustorium（P）。样品中寄生虫母根/茎（箭头）的存在可以分析Haustorium血管组织。矩形表示用于分析的样品段。比例尺 = 2 厘米。请点击此处查看此图的大图。
随着显微CT成为植物科学中越来越流行的技术，有关于样品扫描，三维重建，分割和分析的指南，协议和文献3，10，24。因此，这里不讨论这些步骤。与任何想象技术一样，适当的样品处理和安装是一个基本程序，尽管经常是一个被忽视的过程。出于这个原因，该协议侧重于制备用于显微CT扫描的Haustorium样品。更具体地说，该协议描述了两种将造影剂引入Haustorium样品的方法，以改善Haustorium中不同组织和细胞类型的可视化，以促进检测宿主根/茎内的寄生组织，并分析寄生虫 – 宿主血管连接在三个维度。这里描述的制备也可以适用于其他工厂结构的分析。
使用了五个物种来更好地说明此处描述的方案的便利性。每个物种代表寄生开花植物的五个功能群之一，从而解决了与每个组的功能相关的特定点。选择Pyrularia pubera（Santalaceae）来代表真植寄生虫，它们在地下发芽并形成多个haustoria，将寄生虫连接到其宿主的根部25。由这些植物产生的Haustoria通常是脆弱的，并且很容易与主体26撕裂（图1A），因此需要更精细的处理过程。内寄生虫在这里以最小内脏（内脏科）表示。该功能组中的物种仅在其宿主体外短时间内可见（图1B），并且其大部分生命周期都以显着减少和嵌入宿主组织的菌丝样细胞链的形式存在25。第三个功能群包括寄生藤本，它们在地面上发芽，但仅形成基本的根，依赖于附着在寄主植物茎上的多个haustoria25（图1C）。在这里，这个官能团以美洲蜥蜴（卷曲科）为代表。与寄生藤相反，槲寄生直接在其寄主植物的树枝上发芽，并发展出多个或孤立的Haustoria25。选择用于说明该功能群的物种是Struthanthus martianus（Loranthaceae），它与宿主分支形成各种连接（图1D）。使用显微CT和光学显微镜组合对孤立槲寄生的分析可以在Teixeira-Costa&Ceccantini17中找到。最后，专性根寄生虫包括在地面上发芽并穿透寄主植物根部的物种，它们从最早的生长阶段就完全依赖寄主植物25。这些植物在这里以Scybalium fungiforme（Balanophoraceae）为代表，其产生大型块茎状Haustoria（图1E）。
该方案中使用的所有植物样品均固定在70%福尔马林乙酸醇（FAA 70）中。取样时的固定对于保存植物组织至关重要，尤其是在需要后续解剖分析的情况下。在寄生植物Haustorium的情况下，固定也是必不可少的，因为该器官通常主要由非木质化的实质细胞20组成。植物组织固定的详细方案，包括固定溶液的制备，可以在别处找到27。另一方面，固定剂或多或少会导致样品物理和化学性质的改变，使其不适合特定的生物力学和组织化学分析。因此，新鲜样品，即在制备前立即收集的非固定材料，也可以与该方案一起使用。有关如何处理新鲜样品的详细信息以及固定材料的故障排除建议，请参见讨论部分。
Protocol
Representative Results
Discussion
使用重金属溶液提高植物组织对比度已成为显微CT分析样品制备的关键步骤。Staedler等人已经测试了植物微观形态学实验室中常见的几种化合物，他们建议使用磷钨酸盐作为穿透样品和增加对比度指数8的最有效剂。在分析P. pubera的Haustorium时获得的结果证实了这一建议。在造影剂应用方面，Steadler等人描述造影剂溶液在1至8天内被动渗透通过分析的材料（花…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我要感谢Simone Gomes Ferreira博士（巴西圣保罗大学显微断层扫描实验室）和Greg Lin博士（美国哈佛大学纳米系统中心）为不同的显微断层扫描系统和数据分析软件提供了最重要的帮助和不可或缺的用户培训。我还要感谢康涅狄格大学（美国）EEB温室的工作人员，特别是克林顿·莫尔斯和马修·欧宝提供 Viscum最小标本。John Wenzel博士为 耻骨吡咯菌的采样提供了机会和巨大的帮助。MSc. Carolina Bastos，MSc. Yasmin Hirao和Talitha Motta极大地帮助了 Scybalium fungiforme的采样。Ariadne Furtado博士、Fernanda Oliveira博士和Maria Aline Neves博士为使用福洛辛B分析内生真菌提供了参考。布鲁塞尔自由大学的视频录制是在Philippe Claeys博士，Christophe Snoeck博士，Jake Griffith硕士，Barabara Veselka博士和Harry Olde Venterink博士的帮助下实现的。资金由高等教育人员改进协调会（CAPES，巴西）和哈佛大学标本馆（美国）提供。
Materials
| 3D X-ray microscope (XRM) system | Zeiss Versa 620 | used to scan Pyrularia pubera | |
| 3D X-ray microscope + A2:D22 | Zeiss | Versa 620 | Used for scanning the species P. pubera |
| CT-Pro 3D software | Nikon | version XT 3.1.11 | Used for three-dimensional reconstruction of scans |
| CT-Vox software | Bruker | version 3.3.1 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Dragonfly software | Object Research Systems – ORS | version | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Glass vials | Glass Vials Inc. SE | V2708C-FM-SP | Sold by VWR – USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi |
| Inspect-X | Zeiss | version XT 3.1.11 | Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system |
| Iodine solution 0.0282 N | WR Chemicals BDH | BDH7422-1 | Sold by VWR – USA |
| Lead Nitrate II PA 500 g | Vetec | 361.08 | Sold by SPLab |
| Microtomography scanner | Bruker | Skyscan1176 | Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme |
| Microtomography scanner | Nikon | X-Tek HMXST225 | Used for scanning the species V. minimum |
| NRecon software | Bruker | version 1.0.0 | Used for three-dimensional reconstruction |
| Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 101410-756 | Sold by VWR – USA |
| Plastic film (Parafilm) | Heathrow Scientific | PM996 | Sold by VWR – USA |
| Plastic IV bag 500 mL | Taylor | 3478 | Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude |
| PVC tubing 3/4'' | Nalge Nunc International | SC63013-164 | Sold by VWR – USA |
| Scanning system | Nikon X-Tek HMXST225 | used to scan Viscum minimum | |
| Scanning system | Bruker Skyscan 1176 | used to scan C. americana | |
| Scout-and-ScanTM software | Zeiss | version 16 | Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans |
| Three-way valve | ToToT | DMTWVS-5 | Sold by Amazon USA |
| Two-part syringe | HSW Henke-Ject | 4850001000 | Used without the plunger |
| Vacuum chamber | Binder | 80080-434 | Sold by VWR – USA; includes pump and connecting tubes |
| VG Studio Max software | Volume Graphics | version 3.0 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
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