Sfruttare la scansione micro-CT per analizzare le interazioni parassitarie pianta-ospite

Summary

Micro-CT è uno strumento non distruttivo in grado di analizzare le strutture delle piante in tre dimensioni. Il presente protocollo descrive la preparazione del campione per sfruttare la micro-CT per analizzare la struttura e la funzione delle piante parassite. Diverse specie sono utilizzate per evidenziare i vantaggi di questo metodo se accoppiato con preparazioni specifiche.

Abstract

La scansione micro-CT è diventata uno strumento consolidato nello studio della struttura e della funzione dell’impianto. La sua natura non distruttiva, unita alla possibilità di visualizzazione tridimensionale e sezionamento virtuale, ha permesso analisi nuove e sempre più dettagliate di organi vegetali complessi. Possono anche essere esplorate le interazioni tra le piante, comprese quelle tra le piante parassite e i loro ospiti. Tuttavia, la preparazione del campione prima della scansione diventa cruciale a causa dell’interazione tra queste piante, che spesso differiscono nell’organizzazione e nella composizione dei tessuti. Inoltre, l’ampia diversità delle piante da fiore parassite, che vanno dai corpi vegetativi altamente ridotti agli alberi, alle erbe e agli arbusti, deve essere considerata durante il campionamento, il trattamento e la preparazione del materiale ospite del parassita. Qui vengono descritti due diversi approcci per introdurre soluzioni di contrasto nel parassita e/o nelle piante ospiti, concentrandosi sull’analisi dell’haustorium. Questo organo promuove la connessione e la comunicazione tra le due piante. Seguendo un approccio semplice, i dettagli dell’organizzazione del tessuto haustorium possono essere esplorati tridimensionalmente, come mostrato qui per le specie parassite eufitoidi, vite e vischio. La selezione di specifici agenti di contrasto e approcci applicativi consente anche un’osservazione dettagliata della diffusione dell’endoparassita all’interno del corpo ospite e il rilevamento della connessione diretta vaso-vaso tra parassita e ospite, come mostrato qui per un parassita radice obbligato. Pertanto, il protocollo discusso qui può essere applicato all’ampia diversità delle piante da fiore parassite per far progredire la comprensione del loro sviluppo, struttura e funzionamento.

Introduction

La tomografia microcomputerizzata a raggi X ad alta risoluzione (micro-CT) è un metodo di imaging in cui più radiografie (proiezioni) di un campione vengono registrate da diversi angoli di visione e successivamente utilizzate per fornire una ricostruzione virtuale del campione¹. Questo oggetto virtuale può quindi essere analizzato, manipolato e segmentato, consentendo l’esplorazione non distruttiva in tre dimensioni². Inizialmente progettata per analisi mediche e successivamente per applicazioni industriali, la micro-CT offre anche il vantaggio di visualizzare organi interni e tessuti senza la necessità di procedure invasive³. Come altre forme di imaging, la micro-CT funziona con un compromesso tra il campo visivo e la dimensione dei pixel, il che significa che l’imaging ad alta risoluzione di campioni di grandi dimensioni è quasi irraggiungibile⁴. I progressi nell’uso di sorgenti di raggi X ad alta energia (cioè sincrotrone) e ingrandimento ottico secondario sono costantemente fatti, consentendo alla risoluzione più piccola di raggiungere meno di 100 nm ^5,6. Tuttavia, sono necessari tempi di scansione più lunghi per campioni di grandi dimensioni, aumentando la possibilità di artefatti dovuti al movimento o alla deformazione del campione all’interno dello scanner. Inoltre, la micro-CT è generalmente limitata dalle variazioni di densità naturale all’interno del campione e dal modo in cui il campione interagisce con i raggi X. Mentre una dose di raggi X più elevata è la migliore per penetrare campioni più densi, è meno efficiente nel catturare le variazioni di densità all’interno e tra il campione e il suo mezzo circostante⁷. D’altra parte, una dose di raggi X inferiore offre meno potere di penetrazione e spesso richiede tempi di scansione più lunghi ma una maggiore sensibilità nel rilevamento della densità⁷.

Queste restrizioni hanno a lungo ostacolato l’uso della microtomografia per le scienze vegetali, dato che la maggior parte dei tessuti vegetali sono composti da tessuto leggero (non denso) con basso assorbimento di raggi X⁸. Le prime applicazioni della micro-CT si sono concentrate sulla mappatura delle reti radicali all’interno della matrice del suolo ^9,10. Successivamente, le strutture vegetali con differenze più significative nella densità dei tessuti, come il legno, iniziarono a essere esplorate. Ciò ha permesso indagini sulla funzionalità xilematica 11,12, lo sviluppo di organizzazioni tissutali complesse^13,14 e le interazioni tra piante^15,16,17. L’analisi dei tessuti molli e omogenei si sta diffondendo grazie ai mezzi di contrasto, che sono ormai una procedura standard nelle preparazioni per la scansione micro-TC di campioni vegetali. Tuttavia, i protocolli per l’introduzione del contrasto possono avere risultati diversi a seconda del volume del campione, delle proprietà strutturali e del tipo di soluzione utilizzata⁸. Idealmente, l’agente di contrasto dovrebbe migliorare la distinzione tra i diversi tessuti, consentire la valutazione della funzionalità del tessuto / organo e / o fornire informazioni biochimiche su un tessuto¹⁸. Pertanto, un adeguato trattamento, preparazione e montaggio del campione prima della scansione diventano cruciali per qualsiasi analisi micro-CT.

Micro-CT della pianta parassita haustorium
Le piante da fiore parassitarie rappresentano un gruppo funzionale distinto di angiosperme caratterizzate da un organo noto come haustorium¹⁹. Questo organo multicellulare, un ibrido evolutivo tra uno stelo modificato e una radice, agisce sull’attaccamento, la penetrazione e il contatto dell’ospite da parte di un parassita²⁰. Per questo motivo, l’haustorium è considerato “incarnare l’idea stessa di parassitismo tra le piante”²¹. Una comprensione dettagliata dello sviluppo, della struttura e del funzionamento di questo organo è fondamentale per l’ecologia delle piante parassite, l’evoluzione e gli studi di gestione. Tuttavia, la complessità complessiva delle piante parassite e la struttura e l’haustoria altamente modificate spesso ostacolano l’analisi e il confronto dettagliati. Anche le connessioni di Haustorium sono di solito estese e non omogenee nella distribuzione tissutale e cellulare (Figura 1). In questo contesto, mentre lavorare con piccoli frammenti di tessuto consente una manipolazione più facile e una risoluzione più elevata, può portare a conclusioni errate sull’architettura tridimensionale di strutture complesse, come l’haustorio della pianta parassita.

Sebbene esista una vasta letteratura sull’anatomia e l’ultrastruttura dell’haustorio per la maggior parte delle specie di piante parassite, l’organizzazione tridimensionale e la relazione spaziale tra parassiti e tessuti ospiti rimane poco esplorata¹⁷. In un recente lavoro di Masumoto et ^al.22, oltre 300 sezioni seriali di microtomo semisottili sono state visualizzate e ricostruite in un oggetto virtuale tridimensionale che rappresenta l’haustorio di due specie di parassiti. L’eccellente livello di dettaglio di questo metodo fornisce informazioni senza precedenti sulla struttura 3D cellulare e anatomica dell’haustorium. Tuttavia, una tecnica così dispendiosa in termini di tempo impedirebbe un’analisi simile nei parassiti con connessioni haustorium più estese. L’utilizzo della micro-CT emerge come un ottimo strumento per l’analisi tridimensionale di complessi e spesso ingombranti haustoria di piante parassite. Sebbene non sostituiscano il sezionamento anatomico dettagliato e altre forme complementari di analisi microscopiche^17,23, i risultati ottenuti tramite scansione micro-CT, in particolare per campioni di grandi dimensioni, possono anche servire come guida per dirigere il sottocampionamento di segmenti più piccoli, che possono quindi essere analizzati utilizzando altri strumenti, come la microscopia confocale ed elettronica^, o rianalizzati con sistemi micro-CT ad alta risoluzione.

Figura 1: Piante parassite di diversi gruppi funzionali utilizzati in questo protocollo. Parassita eufitoide Pyrularia pubera (A), endoparassita Viscum minimo (B) con frutti verdi (cerchio nero tratteggiato), vite parassita Cuscuta americana (C), vischio Struthanthus martianus (D), parassita radice obbligata Scybalium fungiforme (E). Segmenti della radice ospite (Hr) o del fusto (Hs) facilitano l’applicazione del contrasto nell’haustorio parassita (P). La presenza di radice/stelo madre del parassita (frecce) nel campione consente l’analisi dell’organizzazione dei vasi di haustorio. I rettangoli indicano i segmenti del campione utilizzato per l’analisi. Barre della scala = 2 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Poiché la micro-CT diventa una tecnica sempre più popolare nelle scienze vegetali, ci sono guide, protocolli e letteratura che si occupano di scansione dei campioni, ricostruzione tridimensionale, segmentazione e analisi ^3,10,24. Pertanto, questi passaggi non saranno discussi qui. Come per qualsiasi tecnica di imagining, il trattamento e il montaggio appropriati dei campioni sono fondamentali, anche se spesso sono una procedura trascurata. Per questo motivo, questo protocollo si concentra sulla preparazione di campioni di haustorium per la scansione micro-CT. Più specificamente, questo protocollo descrive due approcci per introdurre agenti di contrasto nei campioni di haustorio per migliorare la visualizzazione di diversi tessuti e tipi di cellule nell’haustorium, per facilitare la rilevazione di tessuto parassita all’interno della radice / stelo ospite e per analizzare le connessioni vascolari parassita-ospite in tre dimensioni. I preparati qui descritti possono anche essere adattati all’analisi di altre strutture vegetali.

Cinque specie sono state utilizzate per illustrare meglio la convenienza del protocollo qui descritto. Ogni specie rappresenta uno dei cinque gruppi funzionali di piante da fiore parassite, affrontando così punti specifici relativi alla funzionalità di ciascun gruppo. Pyrularia pubera (Santalaceae) è stata scelta per rappresentare i parassiti eufitoidi, che germinano nel terreno e formano molteplici haustoria che collegano il parassita alle radici dei suoi ospiti²⁵. Le haustoria create da queste piante sono spesso tenui e facilmente strappate dall’ospite²⁶ (Figura 1A), richiedendo quindi un processo di manipolazione più delicato. Gli endoparassiti sono rappresentati qui da Viscum minimum (Viscaceae). Le specie di questo gruppo funzionale sono visibili solo al di fuori del corpo dei loro ospiti per brevi periodi (Figura 1B) e vivono la maggior parte dei loro cicli vitali come filamenti di cellule significativamente ridotti e simili a miceli incorporati nei tessuti ospiti²⁵. Un terzo gruppo funzionale comprende viti parassite, che germinano sul terreno ma formano solo radici rudimentali, basandosi su più haustoria che si attaccano ai fusti delle piante ospiti²⁵ (Figura 1C). Qui, questo gruppo funzionale è rappresentato da Cuscuta americana (Convolvulaceae). Contrariamente alle viti parassite, i vischi germinano direttamente sui rami delle piante ospiti e sviluppano haustoria multiple o solitarie²⁵. La specie scelta per illustrare questo gruppo funzionale è Struthanthus martianus (Loranthaceae), che forma varie connessioni con il ramo ospite (Figura 1D). L’analisi del vischio solitario haustoria utilizzando una combinazione di micro-TC e microscopia ottica può essere trovata in Teixeira-Costa & Ceccantini¹⁷. Infine, i parassiti delle radici obbligate comprendono le specie che germinano sul terreno e penetrano nelle radici delle piante ospiti, da cui dipendono interamente fin dalle prime fasi di crescita²⁵. Queste piante sono qui rappresentate da Scybalium fungiforme (Balanophoraceae), che producono grandi haustoria simili a tuberi (Figura 1E).

Tutti i campioni di piante utilizzati in questo protocollo sono stati fissati in un alcol di acido acetico formalina al 70% (FAA 70). La fissazione al campionamento è fondamentale per preservare i tessuti vegetali, soprattutto se sono necessarie successive analisi anatomiche. Nel caso dell’haustorio delle piante parassite, anche la fissazione è essenziale, poiché questo organo è spesso composto principalmente da cellule di parenchima non lignificate²⁰. Protocolli dettagliati per la fissazione del tessuto vegetale, compresa la preparazione di soluzioni fissative, possono essere trovati altrove²⁷. D’altra parte, in misura maggiore o minore, i fissativi possono causare alterazioni delle proprietà fisiche e chimiche di un campione, rendendolo inadatto per specifiche analisi biomeccaniche e istochimiche. Pertanto, anche i campioni freschi, cioè il materiale non fissato raccolto immediatamente prima della preparazione, possono essere utilizzati con questo protocollo. I dettagli su come gestire nuovi campioni e i suggerimenti per la risoluzione dei problemi relativi al materiale fissato sono forniti nella sezione di discussione.

Protocol

1. Selezione del campione di piante parassite Raccogliere l’intero haustorio della pianta parassita, compreso il fusto / radice dell’ospite attaccato e segmenti di entrambe le estremità prossimali e distali dell’organo ospite parassitato; La lunghezza ideale di ogni segmento equivale al doppio del diametro dell’haustorium.NOTA: Per l’haustoria laterale, includere parte del fusto/radice madre del parassita da cui si è formato l’haustorio (Figura 1A,B,D…

Representative Results

L’haustorio delle piante parassite è un organo complesso che comprende diversi tessuti e tipi di cellule che si intrecciano e si collegano con i tessuti di un’altra pianta, utilizzata come ospite20. La scansione micro-CT può essere sfruttata per comprendere meglio questa complessa struttura in modo non distruttivo e tridimensionale quando si analizzano sia piccole (Figura 1A-C) che grandi (Figura 1D,E) haustori…

Discussion

L’uso di soluzioni di metalli pesanti per migliorare il contrasto dei tessuti vegetali è diventato un passo cruciale nella preparazione del campione per l’analisi micro-CT. Diversi composti comunemente disponibili nei laboratori di micromorfologia vegetale sono stati testati da Staedler et al., che raccomandano l’uso del fosfotungstato come agente più efficace nel penetrare i campioni e aumentare l’indice di contrasto⁸. I risultati ottenuti qui nell’analisi dell’haustorium di P. pubera …

Materials

3D X-ray microscope (XRM) system		Zeiss Versa 620	used to scan Pyrularia pubera
3D X-ray microscope + A2:D22	Zeiss	Versa 620	Used for scanning the species P. pubera
CT-Pro 3D software	Nikon	version XT 3.1.11	Used for three-dimensional reconstruction of scans
CT-Vox software	Bruker	version 3.3.1	Used for analyses and acquisition of images and videos
Dragonfly software	Object Research Systems – ORS	version	Used for analyses and acquisition of images and videos
Glass vials	Glass Vials Inc. SE	V2708C-FM-SP	Sold by VWR – USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi
Inspect-X	Zeiss	version XT 3.1.11	Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system
Iodine solution 0.0282 N	WR Chemicals BDH	BDH7422-1	Sold by VWR – USA
Lead Nitrate II PA 500 g	Vetec	361.08	Sold by SPLab
Microtomography scanner	Bruker	Skyscan1176	Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme
Microtomography scanner	Nikon	X-Tek HMXST225	Used for scanning the species V. minimum
NRecon software	Bruker	version 1.0.0	Used for three-dimensional reconstruction
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	101410-756	Sold by VWR – USA
Plastic film (Parafilm)	Heathrow Scientific	PM996	Sold by VWR – USA
Plastic IV bag 500 mL	Taylor	3478	Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude
PVC tubing 3/4''	Nalge Nunc International	SC63013-164	Sold by VWR – USA
Scanning system		Nikon X-Tek HMXST225	used to scan Viscum minimum
Scanning system		Bruker Skyscan 1176	used to scan C. americana
Scout-and-ScanTM software	Zeiss	version 16	Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans
Three-way valve	ToToT	DMTWVS-5	Sold by Amazon USA
Two-part syringe	HSW Henke-Ject	4850001000	Used without the plunger
Vacuum chamber	Binder	80080-434	Sold by VWR – USA; includes pump and connecting tubes
VG Studio Max software	Volume Graphics	version 3.0	Used for analyses and acquisition of images and videos