Nutzung von Mikro-CT-Scans zur Analyse parasitärer Pflanzen-Wirt-Interaktionen

Summary

Die Mikro-CT ist ein zerstörungsfreies Werkzeug, mit dem Pflanzenstrukturen dreidimensional analysiert werden können. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Probenvorbereitung zur Nutzung von Mikro-CT zur Analyse der parasitären Pflanzenstruktur und -funktion. Verschiedene Spezies werden verwendet, um die Vorteile dieser Methode in Verbindung mit spezifischen Präparaten hervorzuheben.

Abstract

Mikro-CT-Scans haben sich zu einem etablierten Werkzeug zur Untersuchung der Struktur und Funktion von Pflanzen entwickelt. Seine zerstörungsfreie Natur, kombiniert mit der Möglichkeit der dreidimensionalen Visualisierung und virtuellen Schnitte, hat eine neuartige und immer detailliertere Analyse komplexer Pflanzenorgane ermöglicht. Auch die Wechselwirkungen zwischen Pflanzen, auch zwischen parasitären Pflanzen und ihren Wirten, können erforscht werden. Die Probenvorbereitung vor dem Scannen ist jedoch aufgrund der Interaktion zwischen diesen Pflanzen, die sich oft in der Gewebeorganisation und -zusammensetzung unterscheiden, von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus muss bei der Probenahme, Behandlung und Aufbereitung von Parasiten-Wirtsmaterial die große Vielfalt parasitärer Blütenpflanzen berücksichtigt werden, die von stark reduzierten vegetativen Körpern bis hin zu Bäumen, Kräutern und Sträuchern reicht. Hier werden zwei verschiedene Ansätze beschrieben, um Kontrastmittel in den Parasiten und/oder die Wirtspflanzen einzubringen, wobei der Schwerpunkt auf der Analyse des Haustoriums liegt. Dieses Organ fördert die Verbindung und Kommunikation zwischen den beiden Pflanzen. Mit einem einfachen Ansatz können Details der Struktur des Haustoriumsgewebes dreidimensional erforscht werden, wie hier für die parasitären Arten der Euphytoiden, der Rebe und der Mistel gezeigt wird. Die Auswahl spezifischer Kontrastmittel und Applikationsansätze ermöglicht auch eine detaillierte Beobachtung der Ausbreitung von Endoparasiten im Wirtskörper und den Nachweis einer direkten Gefäß-zu-Gefäß-Verbindung zwischen Parasit und Wirt, wie hier für einen obligaten Wurzelparasiten gezeigt. Daher kann das hier diskutierte Protokoll auf die große Vielfalt parasitärer Blütenpflanzen angewendet werden, um das Verständnis ihrer Entwicklung, Struktur und Funktionsweise zu verbessern.

Introduction

Die hochauflösende Röntgen-Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) ist ein bildgebendes Verfahren, bei dem mehrere Röntgenaufnahmen (Projektionen) einer Probe aus unterschiedlichen Blickwinkeln aufgenommen und später zur virtuellen Rekonstruktion der Probe verwendet werden¹. Dieses virtuelle Objekt kann dann analysiert, manipuliert und segmentiert werden, was eine zerstörungsfreie Erkundung in drei Dimensionen^{ermöglicht 2}. Ursprünglich für medizinische Analysen und später für industrielle Anwendungen konzipiert, bietet die Mikro-CT auch den Vorteil, innere Organe und Gewebe ohne invasive Eingriffe sichtbar zu machen³. Wie andere Formen der Bildgebung arbeitet auch die Mikro-CT mit einem Kompromiss zwischen Sichtfeld und Pixelgröße, was bedeutet, dass eine hochauflösende Bildgebung großer Proben nahezu unerreichbar ist⁴. Fortschritte bei der Verwendung von hochenergetischen Röntgenquellen (z. B. Synchrotron) und sekundärer optischer Vergrößerung werden ständig gemacht, so dass die kleinste Auflösung unter 100 nm erreicht^{werden kann 5,6}. Nichtsdestotrotz sind bei großen Proben längere Scanzeiten erforderlich, was die Wahrscheinlichkeit von Artefakten aufgrund von Probenbewegungen oder Verformungen im Inneren des Scanners erhöht. Darüber hinaus ist die Mikro-CT im Allgemeinen durch natürliche Dichteschwankungen innerhalb der Probe und die Art und Weise, wie die Probe mit Röntgenstrahlen interagiert, begrenzt. Während eine höhere Röntgendosis am besten geeignet ist, um dichtere Proben zu durchdringen, ist sie weniger effizient bei der Erfassung von Dichteschwankungen innerhalb und zwischen der Probe und dem umgebenden Medium⁷. Auf der anderen Seite bietet eine geringere Röntgendosis eine geringere Durchdringungsleistung und erfordert oft längere Scanzeiten, aber eine höhere Empfindlichkeit bei der Dichtedetektion⁷.

Diese Einschränkungen haben den Einsatz der Mikrotomographie für die Pflanzenwissenschaften lange Zeit behindert, da die meisten Pflanzengewebe aus leichtem (nicht dichtem) Gewebe mit geringer Röntgenabsorption bestehen⁸. Die ersten Anwendungen der Mikro-CT konzentrierten sich auf die Kartierung von Wurzelnetzwerken innerhalb der Bodenmatrix ^9,10. Später wurden Pflanzenstrukturen mit deutlicheren Unterschieden in der Gewebedichte, wie z. B. Holz, erforscht. Dies ermöglichte Untersuchungen der Xylemfunktionalität^11,12, der Entwicklung komplexer Gewebeorganisationen 13,14 und der Interaktionen zwischen Pflanzen^15,16,17. Die Analyse von weichem und homogenem Gewebe wird durch Kontrastmittel, die heute zum Standardverfahren in Präparaten für die Mikro-CT-Untersuchung von Pflanzenproben gehören, immer weiter verbreitet. Protokolle für die Kontrastmitteleinbringung können jedoch je nach Probenvolumen, strukturellen Eigenschaften und Art der verwendeten Lösung zu unterschiedlichen Ergebnissen führen⁸. Im Idealfall sollte das Kontrastmittel die Unterscheidung zwischen verschiedenen Geweben verbessern, eine Bewertung der Gewebe-/Organfunktionalität ermöglichen und/oder biochemische Informationen über ein Gewebe liefern¹⁸. Daher ist eine angemessene Probenbehandlung, -vorbereitung und -montage vor dem Scannen für jede Mikro-CT-Analyse von entscheidender Bedeutung.

Mikro-CT des parasitären Pflanzenhaustoriums
Parasitäre Blütenpflanzen stellen eine eigene funktionelle Gruppe von Angiospermen dar, die durch ein Organ gekennzeichnet ist, das als Haustorium¹⁹ bekannt ist. Dieses mehrzellige Organ, ein Entwicklungshybrid zwischen einem modifizierten Stamm und einer Wurzel, wirkt auf die Anheftung, das Eindringen und den Kontakt des Wirts durch einen Parasiten²⁰. Aus diesem Grund wird davon ausgegangen, dass das Haustorium “die Idee des Parasitismus unter den Pflanzen verkörpert”²¹. Ein detailliertes Verständnis der Entwicklung, Struktur und Funktionsweise dieses Organs ist entscheidend für die Ökologie, Evolution und Managementstudien parasitärer Pflanzen. Dennoch erschweren die Gesamtkomplexität der parasitären Pflanzen und die stark veränderte Struktur und Haustorien oft eine detaillierte Analyse und einen Vergleich. Auch die Haustoriumverbindungen sind in der Regel umfangreich und in der Gewebe- und Zellverteilung nicht homogen (Abbildung 1). In diesem Zusammenhang ermöglicht die Arbeit mit kleinen Gewebefragmenten zwar eine einfachere Manipulation und höhere Auflösung, kann aber zu falschen Rückschlüssen auf die dreidimensionale Architektur komplexer Strukturen, wie z.B. der parasitären Pflanze Haustorium, führen.

Obwohl es für die meisten parasitären Pflanzenarten eine umfangreiche Literatur über die Anatomie und Ultrastruktur des Haustoriums gibt, ist die dreidimensionale Organisation und die räumliche Beziehung zwischen Parasiten- und Wirtsgewebe noch wenig erforscht¹⁷. In einer kürzlich erschienenen Arbeit von Masumoto et ^al.22 wurden über 300 serielle halbdünne Mikrotomschnitte abgebildet und zu einem dreidimensionalen virtuellen Objekt rekonstruiert, das das Haustorium zweier Parasitenarten darstellt. Der hohe Detaillierungsgrad dieser Methode ermöglicht noch nie dagewesene Einblicke in die zelluläre und anatomische 3D-Struktur des Haustoriums. Eine derart zeitaufwändige Technik würde jedoch eine ähnliche Analyse bei Parasiten mit umfangreicheren Haustoriumverbindungen verbieten. Der Einsatz der Mikro-CT erweist sich als hervorragendes Werkzeug für die dreidimensionale Analyse komplexer und oft sperriger Haustorien parasitärer Pflanzen. Obwohl sie kein Ersatz für detaillierte anatomische Schnitte und andere ergänzende Formen der mikroskopischen Analyse^{sind 17,23}, können die durch Mikro-CT-Scans erhaltenen Ergebnisse, insbesondere bei großen Proben, auch als Leitfaden für die Unterprobenahme kleinerer Segmente dienen^, die dann mit anderen Instrumenten wie Konfokal- und Elektronenmikroskopie analysiert oder mit hochauflösenden Mikro-CT-Systemen erneut analysiert werden können.

Abbildung 1: Parasitische Pflanzen verschiedener funktioneller Gruppen, die in diesem Protokoll verwendet werden. Euphytoide Parasit Pyrularia pubera (A), Endoparasit Viscum minimum (B) mit grünen Früchten (gestrichelter schwarzer Kreis), parasitische Rebe Cuscuta americana (C), Mistel Struthanthus martianus (D), obligater Wurzelparasit Scybalium fungiforme (E). Segmente der Wirtswurzel (Hr) oder des Stammes (Hs) erleichtern die Anwendung von Kontrastmitteln in das Haustorium des Parasiten (P). Das Vorhandensein der Mutterwurzel/des Stammes des Parasiten (Pfeile) in der Probe ermöglicht die Analyse der Organisation der Haustoriumgefäße. Rechtecke kennzeichnen Segmente der Stichprobe, die für die Analyse verwendet werden. Maßstabsleisten = 2 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Da die Mikro-CT zu einer immer beliebteren Technik in den Pflanzenwissenschaften wird, gibt es Leitfäden, Protokolle und Literatur, die sich mit dem Scannen von Proben, der dreidimensionalen Rekonstruktion, der Segmentierung und der Analyse befassen ^3,10,24. Daher werden diese Schritte hier nicht besprochen. Wie bei jeder bildgebenden Technik ist die angemessene Behandlung und Einbettung von Proben von grundlegender Bedeutung, auch wenn sie oft übersehen wird. Aus diesem Grund konzentriert sich dieses Protokoll auf die Vorbereitung von Haustoriumproben für Mikro-CT-Scans. Genauer gesagt beschreibt dieses Protokoll zwei Ansätze zur Einbringung von Kontrastmitteln in Haustoriumproben, um die Visualisierung verschiedener Gewebe und Zelltypen im Haustorium zu verbessern, die Detektion von parasitärem Gewebe innerhalb der Wirtswurzel/des Stammes zu erleichtern und die Parasit-Wirt-Gefäßverbindungen in drei Dimensionen zu analysieren. Die hier beschriebenen Präparate können auch an die Analyse anderer Pflanzenstrukturen angepasst werden.

Fünf Arten wurden verwendet, um die Zweckmäßigkeit des hier beschriebenen Protokolls besser zu veranschaulichen. Jede Art repräsentiert eine der fünf funktionellen Gruppen parasitärer Blütenpflanzen und spricht damit spezifische Punkte an, die mit der Funktionalität jeder Gruppe zusammenhängen. Pyrularia pubera (Santalaceae) wurde ausgewählt, um euphytoide Parasiten darzustellen, die im Boden keimen und mehrere Haustorien bilden, die den Parasiten mit den Wurzeln seiner Wirte verbinden²⁵. Die von diesen Pflanzen erzeugten Haustorien sind oft dünn und lassen sich leicht vom Wirt²⁶ (Fig. 1A) abreißen, was einen schonenderen Handhabungsprozess erfordert. Endoparasiten werden hier durch Viscum minimum (Viscaceae) repräsentiert. Spezies dieser funktionellen Gruppe sind außerhalb des Körpers ihrer Wirte nur für kurze Zeit sichtbar (Abbildung 1B) und leben den größten Teil ihres Lebenszyklus als deutlich reduzierte und myzelartige Zellstränge, die in Wirtsgewebe eingebettet sind²⁵. Eine dritte funktionelle Gruppe umfasst parasitäre Reben, die am Boden keimen, aber nur rudimentäre Wurzeln bilden und auf mehrere Haustorien angewiesen sind, die an den Stängeln der Wirtspflanzen^{ansetzen 25} (Abbildung 1C). Hier wird diese funktionelle Gruppe durch Cuscuta americana (Convolvulaceae) repräsentiert. Im Gegensatz zu parasitären Reben keimen Misteln direkt an den Zweigen ihrer Wirtspflanzen und entwickeln entweder mehrere oder einzelne Haustorien²⁵. Die Art, die zur Veranschaulichung dieser funktionellen Gruppe ausgewählt wurde, ist Struthanthus martianus (Loranthaceae ), die verschiedene Verbindungen mit dem Wirtszweig eingeht (Abbildung 1D). Die Analyse solitärer Mistelhaustorien mit einer Kombination aus Mikro-CT und Lichtmikroskopie findet sich in Teixeira-Costa & Ceccantini¹⁷. Zu den obligaten Wurzelparasiten schließlich gehören Arten, die am Boden keimen und in die Wurzeln von Wirtspflanzen eindringen, von denen sie von den frühesten Wachstumsstadien an vollständig abhängig sind²⁵. Diese Pflanzen sind hier durch Scybalium fungiforme (Balanophoraceae) vertreten, die große knollenartige Haustorien bilden (Abbildung 1E).

Alle Pflanzenproben, die in diesem Protokoll verwendet wurden, wurden in einem 70%igen Formalinessigsäurealkohol (FAA 70) fixiert. Die Fixierung auf die Probenahme ist entscheidend für die Konservierung von Pflanzengeweben, insbesondere wenn nachträgliche anatomische Analysen erforderlich sind. Auch beim parasitären Pflanzenhaustorium ist eine Fixierung unumgänglich, da dieses Organ oft hauptsächlich aus nicht verholzten Parenchymzellen besteht²⁰. Detaillierte Protokolle für die Fixierung von Pflanzengewebe, einschließlich der Herstellung von Fixierlösungen, finden Sie an anderer Stelle²⁷. Andererseits können Fixiermittel mehr oder weniger zu Veränderungen der physikalischen und chemischen Eigenschaften einer Probe führen, so dass sie für spezifische biomechanische und histochemische Analysen ungeeignet ist. Somit können mit diesem Protokoll auch frische Proben, d.h. nicht fixiertes Material, das unmittelbar vor der Aufbereitung gesammelt wurde, verwendet werden. Details zum Umgang mit neuen Proben und Vorschläge zur Fehlerbehebung bei fixiertem Material finden Sie im Abschnitt “Diskussion”.

Protocol

1. Auswahl parasitärer Pflanzenproben Sammeln Sie das gesamte parasitäre Pflanzenhaustorium, einschließlich des angehängten Wirtsstamms/der Wurzel und der Segmente der proximalen und distalen Enden des parasitierten Wirtsorgans. Die ideale Länge jedes Segments entspricht dem doppelten Durchmesser des Haustoriums.HINWEIS: Fügen Sie bei seitlichen Haustorien einen Teil des Mutterstamms/der Wurzel des Parasiten hinzu, aus dem das Haustorium gebildet wurde (Abbildung …

Representative Results

Das Haustorium parasitischer Pflanzen ist ein komplexes Organ, das aus verschiedenen Geweben und Zelltypen besteht, die sich mit dem Gewebe einer anderen Pflanze verflechten und verbinden, die als Wirt verwendet wird20. Mikro-CT-Scans können genutzt werden, um diese komplexe Struktur auf zerstörungsfreie und dreidimensionale Weise besser zu verstehen, wenn sowohl kleine (Abbildung 1A-C) als auch große (Abbildung 1D,E</…

Discussion

Die Verwendung von Schwermetalllösungen zur Verbesserung des Kontrasts von Pflanzengewebe ist zu einem entscheidenden Schritt bei der Probenvorbereitung für die Mikro-CT-Analyse geworden. Staedler et al. haben mehrere Verbindungen, die üblicherweise in Laboratorien für die Mikromorphologie von Pflanzen verfügbar sind, getestet, die die Verwendung von Phosphowolframat als wirksamstes Mittel bei der Penetration von Proben und der Erhöhung des Kontrastindex^{empfehlen 8}. Die hier erzielten Ergebn…

Materials

3D X-ray microscope (XRM) system		Zeiss Versa 620	used to scan Pyrularia pubera
3D X-ray microscope + A2:D22	Zeiss	Versa 620	Used for scanning the species P. pubera
CT-Pro 3D software	Nikon	version XT 3.1.11	Used for three-dimensional reconstruction of scans
CT-Vox software	Bruker	version 3.3.1	Used for analyses and acquisition of images and videos
Dragonfly software	Object Research Systems – ORS	version	Used for analyses and acquisition of images and videos
Glass vials	Glass Vials Inc. SE	V2708C-FM-SP	Sold by VWR – USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi
Inspect-X	Zeiss	version XT 3.1.11	Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system
Iodine solution 0.0282 N	WR Chemicals BDH	BDH7422-1	Sold by VWR – USA
Lead Nitrate II PA 500 g	Vetec	361.08	Sold by SPLab
Microtomography scanner	Bruker	Skyscan1176	Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme
Microtomography scanner	Nikon	X-Tek HMXST225	Used for scanning the species V. minimum
NRecon software	Bruker	version 1.0.0	Used for three-dimensional reconstruction
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	101410-756	Sold by VWR – USA
Plastic film (Parafilm)	Heathrow Scientific	PM996	Sold by VWR – USA
Plastic IV bag 500 mL	Taylor	3478	Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude
PVC tubing 3/4''	Nalge Nunc International	SC63013-164	Sold by VWR – USA
Scanning system		Nikon X-Tek HMXST225	used to scan Viscum minimum
Scanning system		Bruker Skyscan 1176	used to scan C. americana
Scout-and-ScanTM software	Zeiss	version 16	Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans
Three-way valve	ToToT	DMTWVS-5	Sold by Amazon USA
Two-part syringe	HSW Henke-Ject	4850001000	Used without the plunger
Vacuum chamber	Binder	80080-434	Sold by VWR – USA; includes pump and connecting tubes
VG Studio Max software	Volume Graphics	version 3.0	Used for analyses and acquisition of images and videos