Zonular Liflerin Viskoelastik Özelliklerinin Belirlenmesinde Biyolojik Hazırlık ve Mekanik Teknik
Summary
Protokol, hücre dışı matris viskoelastisitesinin incelenmesi ve protein bileşimine veya çevresel faktörlere bağımlılığı için bir yöntem tanımlamaktadır. Hedeflenen matris sistemi fare zonule’sidir. Yöntemin performansı, vahşi tip zonular liflerin viskoelastik davranışı ile mikrofibril ilişkili glikoprotein-1’den yoksun olanlar karşılaştırılarak gösterilmiştir.
Abstract
Elastikiyet kan damarları, kaslar ve akciğerler gibi dokuların işlevi için gereklidir. Bu özellik çoğunlukla hücre ve dokuları birbirine bağlayan protein meshwork olan hücre dışı matristen (ECM) türetilmiştir. Bir ECM ağının elastik özelliklerinin bileşimiyle nasıl ilişkili olduğu ve ECM’nin gevşeme özelliklerinin fizyolojik bir rol oynayıp oynamadığı, henüz tam olarak ele alınmamış sorulardır. Zorluğun bir kısmı, çoğu ECM sisteminin karmaşık mimarisinde ve ECM bileşenlerinin yapılarından ödün vermeden izole edilmesindeki zorlukta yatmaktadır. Bunun bir istisnası, omurgalıların gözünde bulunan bir ECM sistemi olan zonule’dir. Zonule, lens ve göz duvarı arasındaki hücresiz boşluğu kapsayan yüzlerce ila binlerce mikrometre uzunluğunda liflerden oluşur. Bu raporda, viskoelastik özelliklerini ölçmek ve bireysel protein bileşenlerinin katkısını belirlemek için zonulün son derece organize yapısından yararlanan mekanik bir tekniği açıklıyoruz. Yöntem, lensi ve zonuleyi açığa çıkarmak için sabit bir gözün diseksiyonu içerir ve gerginlikleri izlenirken zonular lifleri eşit olarak uzatan bir barfiks tekniği kullanır. Teknik nispeten ucuzdur, ancak belirli zonular proteinlerden yoksun veya yaşlanmaya sahip farelerde zonular liflerin viskoelastik özelliklerindeki değişiklikleri tespit edecek kadar hassastır. Burada sunulan yöntem öncelikle oküler gelişim ve hastalığı incelemek için tasarlanmış olsa da, elastik ECM’lerin viskoelastik özellikleri ve iyonik konsantrasyon, sıcaklık ve sinyal molekülleriyle etkileşimler gibi dış faktörlerin rolü ile ilgili daha geniş soruları keşfetmek için deneysel bir model olarak da hizmet edebilir.
Introduction
Bir omurgalının gözü, görüntüleri retinaya odaklamaya yardımcı olan canlı bir optik lens içerir1. Lens, Şekil 1A’da gösterildiği gibi hassas, radyal yönelimli fiberlerden oluşan bir sistem tarafından optik eksende askıya alınmıştır. Bir uçta, lifler lens ekvatoru ve diğer ucunda siliary gövdenin yüzeyine bağlanır. Uzunlukları farelerde 150 μm ile insanlarda 1 mm arasında değişen mesafelere yayılır. Toplu olarak, bu lifler Zinn2 zonule, siliary zonule veya sadece zonule olarak bilinir. Oküler travma, hastalık ve bazı genetik bozukluklar zonular liflerin bütünlüğünü etkileyebilir3, bu da nihai başarısızlıklarına ve eşlik eden görme kaybına neden olabilir. Farelerde, lifler çoğunlukla fibrilin-2 proteini içeren bir çekirdeğe sahiptir ve fibrilin-14 bakımından zengin bir mantle ile çevrilidir. Zonular lifler göze özgü olmasına rağmen, vücudun başka yerlerinde bulunan elastin bazlı ECM lifleri ile birçok benzerlik taşırlar. İkincisi bir fibrilin-1 mantle5 ile kaplıdır ve zonular liflerle benzer boyutlara sahiptir6. Gizli dönüştürücü büyüme faktörü β bağlayıcı proteinler (LTBP’ler) ve mikrofibril ilişkili glikoprotein-1 (MAGP-1) gibi diğer proteinler, her iki lif türüyle de ilişkili olarak bulunur7,8,9,10,11. Zonular liflerin elastik modülü 0.18-1.50 MPa12,13,14,15,16 aralığındadır, elastin bazlı liflerinkiyle karşılaştırılabilir (0.3-1.2 MPa)17. Bu mimari ve mekanik benzerlikler, zonule ilişkili proteinlerin rollerine ilişkin herhangi bir içgörünün diğer ECM elastik liflerdeki rollerini aydınlatabileceğine inanmamıza neden olur.
Burada açıklanan yöntemi geliştirmenin temel amacı, kalıtsal göz hastalığının ilerlemesinde spesifik zonular proteinlerin rolü hakkında fikir edinmektir. Genel yaklaşım, vahşi tip farelerdeki zonular liflerin viskoelastik özelliklerini, zonular proteinleri kodlayan genlerde hedeflenen mutasyonları taşıyan farelerinkilerle karşılaştırmaktır. Zonular liflerin elasto-mekanik özelliklerini ölçmek için daha önce çeşitli yöntemler kullanılmış olsa da, hepsi çok daha büyük hayvanların gözleri için tasarlanmıştır12,13,14,15,16. Bu modeller genetik olarak çekişli olmadığı için; farelerin küçük ve narin gözlerine daha uygun deneysel bir yöntem geliştirmeye çalıştık.
Fare zonular liflerinin viskoelastisitesini değerlendirmek için geliştirdiğimiz yöntem, Şekil 1’de görsel olarak özetlenen barfiks tahlil4,18 olarak adlandırdığımız bir tekniktir. Barfiks yönteminin ayrıntılı bir açıklaması ve sonuçların analizi aşağıda verilmiştir. Projede kullanılan üç boyutlu (3D) baskılı parçalar da dahil olmak üzere cihazın yapımını anlatarak başlıyoruz. Daha sonra, gözleri deney için elde etmek ve hazırlamak için kullanılan protokolü detaylandırıyoruz. Son olarak, zonular liflerin viskoelastik özelliklerinin belirlenmesi için veri elde etme konusunda adım adım talimatlar sunuyoruz. Temsili Sonuçlar bölümünde, MAGP-119’dan yoksun farelerden zonular liflerin viskoelastik özellikleri ve yaşla eşleşen vahşi tip hayvanlardan elde edilen bir kontrol seti ile ilgili yöntemimizle daha önce yayınlanmamış verileri paylaşıyoruz. Son olarak, yöntemin avantajları ve sınırlamaları hakkında genel açıklamalar ve çevresel ve biyokimyasal faktörlerin ECM liflerinin viskoelastik özelliklerini nasıl etkilediğini ortaya çıkarabilecek potansiyel deneyler için önerilerle sonlandırıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zonule, liflerin simetrik olarak düzenlendiği ve optik eksen boyunca göz merceği yerinden edilerek aynı şekilde manipüle edilebilen alışılmadık bir ECM sistemidir. Alan ayrıca hücresel bozulma olmadan kolayca erişilebilir ve liflerin kendi yerel durumlarına yakın bir ortamda incelenmesini sağlar. Barfiks tekniği, genetik olarak çekişli bir sistem olan farelerden gelen hassas lifleri manipüle etmek ve mekanik özelliklerini doğru bir şekilde ölçmek için bu ECM sunumundan yararlanır. Bu, anahtar …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH R01 EY029130 (S.B.) ve P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 ve Ines Mandl Araştırma Vakfı (R.P.M.), Marfan Vakfı tarafından desteklenmiş ve Washington Üniversitesi Oftalmoloji ve Görsel Bilimler Bölümü’ne Araştırmadan Körlüğü Önlemeye Yönelik Sınırsız Bir Hibe ile desteklenmiştir. J.R. ayrıca bu projeye destek olarak Sağlık Bilimleri ve Eczacılık Üniversitesi’nden hibe aldı.
Materials
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
References
- Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
- Bassnett, S. Zinn’s zonule. Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100902 (2021).
- Dureau, P. Pathophysiology of zonular diseases. Current Opinion in Ophthalmology. 19 (1), 27-30 (2008).
- Shi, Y., et al. Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers. Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).
- Ushiki, T. Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint. Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).
- Bassnett, S. A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule. Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).
- Todorovic, V., Rifkin, D. B. LTBPs, more than just an escort service. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).
- Mecham, R. P., Gibson, M. A. The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche. Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).
- Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).
- Inoue, T., et al. Latent TGF-β binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).
- De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).
- Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments. Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).
- Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres. Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).
- Fisher, R. F. The ciliary body in accommodation. Transactions of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 105, 208-219 (1986).
- Michael, R., et al. Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).
- van Alphen, G. W., Graebel, W. P. Elasticity of tissues involved in accommodation. Vision Research. 31 (7-8), 1417-1438 (1991).
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).
- Weinbaum, J. S., et al. Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems. Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).
- Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus. British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).
