הכנה ביולוגית וטכניקה מכנית לקביעת תכונות ויסקולסטיות של סיבים זונולריים
Summary
הפרוטוקול מתאר שיטה לחקר צמיגות מטריצה חוץ-תאית ותלותה בהרכב החלבון או בגורמים סביבתיים. מערכת המטריצה הממוקדת היא זונולה של העכבר. הביצועים של השיטה מודגמים על ידי השוואת ההתנהגות הצמיגית של סיבים זונולריים מסוג בר עם אלה חסרים מיקרופיבריל הקשורים גליקופרוטאין-1.
Abstract
גמישות חיונית לתפקוד של רקמות כגון כלי דם, שרירים וריאות. מאפיין זה נגזר בעיקר מהמטריצה החוץ-תאית (ECM), רשת החלבון המחברת תאים ורקמות יחד. כיצד המאפיינים האלסטיים של רשת ECM מתייחסים להרכב שלה, והאם תכונות ההרפיה של ECM ממלאות תפקיד פיזיולוגי, הן שאלות שטרם טופלו במלואן. חלק מהאתגר טמון בארכיטקטורה המורכבת של רוב מערכות ה- ECM והקושי לבודד רכיבי ECM מבלי להתפשר על המבנה שלהם. יוצא מן הכלל אחד הוא zonule, מערכת ECM נמצא בעין של בעלי חוליות. הזונולה כוללת סיבים באורך של מאות עד אלפי מיקרומטרים המשתרעים על פני החלל נטול התאים בין העדשה לקיר העין. בדו”ח זה, אנו מתארים טכניקה מכנית המנצלת את המבנה המאורגן ביותר של הזונול כדי לכמת את תכונותיו הוויסקולאסטיות ולקבוע את תרומתם של רכיבי חלבון בודדים. השיטה כוללת ניתוח של עין קבועה כדי לחשוף את העדשה ואת zonule ומשתמשת בטכניקת משיכה למעלה המותחת את הסיבים הזונולריים באותה מידה בזמן שהמתח שלהם מנוטר. הטכניקה זולה יחסית אך רגישה מספיק כדי לזהות שינויים בתכונות ויסקולסטיות של סיבים זונולריים בעכברים חסרי חלבונים זונולריים ספציפיים או עם הזדקנות. למרות שהשיטה המוצגת כאן מיועדת בעיקר לחקר התפתחות העין ומחלות, היא יכולה לשמש גם כמודל ניסיוני לחקר שאלות רחבות יותר לגבי התכונות הצמיגיות של ECM אלסטיים ותפקידם של גורמים חיצוניים כגון ריכוז יוני, טמפרטורה ואינטראקציות עם מולקולות איתות.
Introduction
העין של בעל חוליות מכילה עדשה אופטית חיה המסייעת למקד תמונות ברשתית1. העדשה תלויה על הציר האופטי על ידי מערכת של סיבים עדינים, רדיאליים, כפי שמודגם באיור 1A. בקצה אחד, הסיבים מתחברים לקו המשווה של העדשה, ובקצה השני, אל פני השטח של הגוף הסילארי. האורכים שלהם משתרעים על פני מרחקים הנעים בין 150 מיקרומטר בעכברים ל 1 מ”מ בבני אדם. באופן קולקטיבי, סיבים אלה ידועים בשם zonule של Zinn2, zonule ciliary, או פשוט zonule. טראומה עינית, מחלות והפרעות גנטיות מסוימות יכולות להשפיע על שלמות הסיבים הזונולריים3, וכתוצאה מכך כישלונם הסופי ואובדן הראייה הנלווה אליהם. בעכברים, הסיבים יש ליבה המורכבת בעיקר של פיברילין חלבון-2, מוקף מעטפת עשירה פיברילין-14. למרות סיבים זונולריים ייחודיים לעין, הם נושאים קווי דמיון רבים סיבי ECM מבוססי אלסטין שנמצאו במקומות אחרים בגוף. אלה האחרונים מכוסים על ידי פיברילין-1 מעטפת5 ויש להם ממדים דומים סיבים זונולריים6. חלבונים אחרים, כגון פקטורי גדילה β חלבון מחייב β (LTBPs) וגליקופרוטאין-1 הקשור למיקרופיבריל (MAGP-1), נמצאים בשיתוף עם שני סוגי הסיבים7,8,9,10,111 הקשורים למיקרופיבריל. מודולוס אלסטי של סיבים זונולריים הוא בטווח של 0.18-1.50 MPa12,13,14,15,16, דומה לזה של סיבים מבוססי אלסטין (0.3-1.2 MPa)17. קווי דמיון ארכיטקטוניים ומכאניים אלה מובילים אותנו להאמין כי כל תובנה לגבי התפקידים של חלבונים הקשורים לזונולה עשויה לעזור להבהיר את תפקידם בסיבים אלסטיים אחרים של ECM.
המטרה העיקרית של פיתוח השיטה המתוארת כאן היא לקבל תובנות על התפקיד של חלבונים זונולריים ספציפיים בהתקדמות של מחלת עיניים תורשתית. הגישה הכללית היא להשוות את המאפיינים הוויסקואלסטיים של סיבים זונולריים בעכברים מסוג בר עם אלה של עכברים הנושאים מוטציות ממוקדות בגנים המקודדים חלבונים זונולריים. בעוד מספר שיטות שימשו בעבר כדי למדוד את המאפיינים האלסטו-מכניים של סיבים זונולריים, כולם תוכננו לעיניים של בעלי חיים גדולים בהרבה12,13,14,15,16. כמו מודלים כאלה אינם ניתנים למתיחה גנטית; ביקשנו לפתח שיטה ניסיונית שמתאימה יותר לעיניים הקטנות והעדינות של העכברים.
השיטה שפיתחנו להערכת הצמיגות של הסיבים הזונוריים של העכבר היא טכניקה שאנו מכנים “בדיקת משיכה למעלה4,18“, המסוכמת חזותית באיור 1. תיאור מפורט של שיטת המשיכה למעלה וניתוח התוצאות מסופק להלן. אנו מתחילים בתיאור בניית המנגנון, כולל החלקים המודפסים התלת מימדיים (3D) המשמשים בפרויקט. לאחר מכן, אנו מפרטים את הפרוטוקול המשמש להשגת והכנת העיניים לניסוי. לבסוף, אנו מספקים הוראות שלב אחר שלב כיצד להשיג נתונים לקביעת המאפיינים הצמיגיים של סיבים זונולריים. בסעיף תוצאות מייצגות, אנו משתפים נתונים שלא פורסמו בעבר שהושגו בשיטה שלנו על התכונות הצמיגיות של סיבים זונולריים מעכברים חסרי MAGP-119, כמו גם ערכת בקרה המתקבלת מחיות בר תואמות גיל. לבסוף, אנו מסיימים עם הערות כלליות על היתרונות והמגבלות של השיטה, והצעות לניסויים פוטנציאליים שעשויים להבהיר כיצד גורמים סביבתיים וביוכימיים משפיעים על המאפיינים הוויסקואלסטיים של סיבי ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
הזונולה היא מערכת ECM יוצאת דופן שבה סיבים מסודרים באופן סימטרי וניתן לתמרן אותם באופן זהה על ידי הזזת עדשת העין לאורך הציר האופטי. ניתן גם לגשת בקלות לחלל ללא הפרעה תאית, מה שמאפשר ללמוד את הסיבים בסביבה הקרובה למצבם הטבעי. טכניקת המשיכה למעלה מנצלת את מצגת ECM זו כדי לתפעל את הסיבים העדינים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 EY029130 (S.B.) ו- P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 וקרן המחקר אינס מנדל (R.P.M.), קרן מרפן, ומענק בלתי מוגבל למחלקה לרפואת עיניים ומדעי הראייה באוניברסיטת וושינגטון ממחקר למניעת עיוורון. ג’יי.אר גם קיבל מענק מהאוניברסיטה למדעי הבריאות ובית המרקחת לתמיכה בפרויקט זה.
Materials
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
References
- Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
- Bassnett, S. Zinn’s zonule. Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100902 (2021).
- Dureau, P. Pathophysiology of zonular diseases. Current Opinion in Ophthalmology. 19 (1), 27-30 (2008).
- Shi, Y., et al. Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers. Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).
- Ushiki, T. Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint. Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).
- Bassnett, S. A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule. Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).
- Todorovic, V., Rifkin, D. B. LTBPs, more than just an escort service. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).
- Mecham, R. P., Gibson, M. A. The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche. Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).
- Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).
- Inoue, T., et al. Latent TGF-β binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).
- De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).
- Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments. Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).
- Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres. Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).
- Fisher, R. F. The ciliary body in accommodation. Transactions of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 105, 208-219 (1986).
- Michael, R., et al. Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).
- van Alphen, G. W., Graebel, W. P. Elasticity of tissues involved in accommodation. Vision Research. 31 (7-8), 1417-1438 (1991).
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).
- Weinbaum, J. S., et al. Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems. Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).
- Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus. British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).
