Preparazione biologica e tecnica meccanica per la determinazione delle proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari
Summary
Il protocollo descrive un metodo per lo studio della viscoelasticità della matrice extracellulare e della sua dipendenza dalla composizione proteica o da fattori ambientali. Il sistema di matrice bersaglio è la zonula del topo. Le prestazioni del metodo sono dimostrate confrontando il comportamento viscoelastico delle fibre zonulari wild-type con quelle prive di glicoproteina-1 associata alle microfibrille.
Abstract
L’elasticità è essenziale per la funzione di tessuti come vasi sanguigni, muscoli e polmoni. Questa proprietà deriva principalmente dalla matrice extracellulare (ECM), la rete proteica che lega insieme cellule e tessuti. Come le proprietà elastiche di una rete ECM si relazionano alla sua composizione, e se le proprietà di rilassamento dell’ECM svolgono un ruolo fisiologico, sono domande che devono ancora essere completamente affrontate. Parte della sfida risiede nella complessa architettura della maggior parte dei sistemi ECM e nella difficoltà di isolare i componenti ECM senza comprometterne la struttura. Un’eccezione è la zonule, un sistema ECM che si trova nell’occhio dei vertebrati. La zonula comprende fibre da centinaia a migliaia di micrometri di lunghezza che coprono lo spazio privo di cellule tra la lente e la parete oculare. In questo rapporto, descriviamo una tecnica meccanica che sfrutta la struttura altamente organizzata della zonula per quantificare le sue proprietà viscoelastiche e per determinare il contributo dei singoli componenti proteici. Il metodo prevede la dissezione di un occhio fisso per esporre la lente e la zonula e impiega una tecnica di pull-up che allunga le fibre zonulari allo stesso modo mentre la loro tensione viene monitorata. La tecnica è relativamente economica ma abbastanza sensibile da rilevare alterazioni nelle proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari in topi privi di proteine zonulari specifiche o con l’invecchiamento. Sebbene il metodo qui presentato sia progettato principalmente per studiare lo sviluppo e la malattia oculare, potrebbe anche servire come modello sperimentale per esplorare domande più ampie riguardanti le proprietà viscoelastiche degli ECM elastici e il ruolo di fattori esterni come la concentrazione ionica, la temperatura e le interazioni con le molecole di segnalazione.
Introduction
L’occhio di un vertebrato contiene una lente ottica vivente che aiuta a mettere a fuoco le immagini sulla retina1. La lente è sospesa sull’asse ottico da un sistema di fibre delicate e orientate radialmente, come illustrato nella Figura 1A. Ad un’estremità, le fibre si attaccano all’equatore della lente e, all’altra, alla superficie del corpo ciliare. Le loro lunghezze coprono distanze che vanno da 150 μm nei topi a 1 mm negli esseri umani. Collettivamente, queste fibre sono conosciute come la zonula di Zinn2, la zonula ciliare o semplicemente la zonula. Traumi oculari, malattie e alcune malattie genetiche possono influenzare l’integrità delle fibre zonulari3, con conseguente eventuale fallimento e conseguente perdita della vista. Nei topi, le fibre hanno un nucleo composto principalmente dalla proteina fibrillina-2, circondata da un mantello ricco di fibrillina-14. Sebbene le fibre zonulari siano uniche per l’occhio, hanno molte somiglianze con le fibre ECM a base di elastina che si trovano altrove nel corpo. Questi ultimi sono coperti da un mantello fibrillin-15 e hanno dimensioni simili alle fibre zonulari6. Altre proteine, come le proteine leganti β che trasformano il latente e la glicoproteina-1 associata alle microfibrille (MAGP-1), si trovano in associazione con entrambi i tipi di fibre7,8,9,10,11. Il modulo elastico delle fibre zonulari è nell’intervallo di 0,18-1,50 MPa12,13,14,15,16, paragonabile a quello delle fibre a base di elastina (0,3-1,2 MPa)17. Queste somiglianze architettoniche e meccaniche ci portano a credere che qualsiasi intuizione sui ruoli delle proteine associate agli zonuli possa aiutare a chiarire i loro ruoli in altre fibre elastiche ECM.
Lo scopo principale dello sviluppo del metodo qui descritto è quello di ottenere informazioni sul ruolo di specifiche proteine zonulari nella progressione della malattia ereditaria degli occhi. L’approccio generale è quello di confrontare le proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari nei topi wild-type con quelle dei topi portatori di mutazioni mirate nei geni che codificano per le proteine zonulari. Mentre diversi metodi sono stati utilizzati in precedenza per misurare le proprietà elasto-meccaniche delle fibre zonulari, tutti sono stati progettati per gli occhi di animali molto più grandi12,13,14,15,16. In quanto tali modelli non sono geneticamente trattabili; abbiamo cercato di sviluppare un metodo sperimentale che fosse più adatto agli occhi piccoli e delicati dei topi.
Il metodo che abbiamo sviluppato per valutare la viscoelasticità delle fibre zonulari di topo è una tecnica a cui ci riferiamo come pull-up assay4,18, che è riassunto visivamente nella Figura 1. Di seguito viene fornita una descrizione dettagliata del metodo pull-up e l’analisi dei risultati. Iniziamo descrivendo la costruzione dell’apparato, comprese le parti tridimensionali (stampate in 3D) utilizzate nel progetto. Successivamente, descriviamo in dettaglio il protocollo utilizzato per ottenere e preparare gli occhi per l’esperimento. Infine, forniamo istruzioni dettagliate su come ottenere dati per la determinazione delle proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari. Nella sezione Risultati rappresentativi, condividiamo dati precedentemente non pubblicati ottenuti con il nostro metodo sulle proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari di topi privi di MAGP-119 e un set di controllo ottenuto da animali selvatici di pari età. Infine, concludiamo con osservazioni generali sui vantaggi e i limiti del metodo e suggerimenti per potenziali esperimenti che possano chiarire come i fattori ambientali e biochimici influenzano le proprietà viscoelastiche delle fibre ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
La zonula è un insolito sistema ECM in cui le fibre sono disposte simmetricamente e possono essere manipolate in modo identico spostando la lente dell’occhio lungo l’asse ottico. Lo spazio può anche essere facilmente accessibile senza interruzioni cellulari, consentendo alle fibre di essere studiate in un ambiente vicino al loro stato nativo. La tecnica pull-up sfrutta questa presentazione ECM per manipolare le fibre delicate dei topi, un sistema geneticamente trattabile, e quantificare con precisione le loro propriet?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NIH R01 EY029130 (S.B.) e P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 e Dalla Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.), dalla Marfan Foundation, e da una sovvenzione illimitata al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive della Washington University da Research to Prevent Blindness. J.R. ha anche ricevuto una sovvenzione dall’Università di Scienze della Salute e Farmacia a sostegno di questo progetto.
Materials
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
References
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