Preparação Biológica e Técnica Mecânica para Determinar Propriedades Viscoelásticas de Fibras Zonulares
Summary
O protocolo descreve um método para o estudo da viscoelasticidade da matriz extracelular e sua dependência da composição proteica ou fatores ambientais. O sistema de matriz alvo é o zonule do rato. O desempenho do método é demonstrado comparando o comportamento viscoelástico das fibraszonulares do tipo selvagem com as que não possuem glicoproteína associada a microfibril-1.
Abstract
A elasticidade é essencial para a função de tecidos como vasos sanguíneos, músculos e pulmões. Esta propriedade é derivada principalmente da matriz extracelular (ECM), a malha proteica que une células e tecidos. Como as propriedades elásticas de uma rede ECM se relacionam com sua composição, e se as propriedades de relaxamento do ECM desempenham um papel fisiológico, são questões que ainda não foram totalmente abordadas. Parte do desafio está na arquitetura complexa da maioria dos sistemas ECM e na dificuldade em isolar componentes ECM sem comprometer sua estrutura. Uma exceção é o zonule, um sistema ECM encontrado no olho de vertebrados. O zonule compreende fibras de centenas a milhares de micrômetros de comprimento que abrangem o espaço livre de células entre a lente e a parede do olho. Neste relatório, descrevemos uma técnica mecânica que aproveita a estrutura altamente organizada do zonule para quantificar suas propriedades viscoelásticas e determinar a contribuição de componentes proteicos individuais. O método envolve dissecção de um olho fixo para expor a lente e o zonule e emprega uma técnica de puxar para cima que estica as fibras zonulares igualmente enquanto sua tensão é monitorada. A técnica é relativamente barata, mas sensível o suficiente para detectar alterações nas propriedades viscoelásticas de fibras zonulares em camundongos sem proteínas zonulares específicas ou com envelhecimento. Embora o método aqui apresentado seja projetado principalmente para estudar o desenvolvimento ocular e doenças, também poderia servir como um modelo experimental para explorar questões mais amplas sobre as propriedades viscoelásticas dos ECM elásticos e o papel de fatores externos como concentração iônica, temperatura e interações com moléculas de sinalização.
Introduction
O olho de um vertebrado contém uma lente óptica viva que ajuda a focar imagens na retina1. A lente é suspensa no eixo óptico por um sistema de fibras delicadas e radialmente orientadas, conforme ilustrado na Figura 1A. Em uma extremidade, as fibras se prendem ao equador da lente e, na outra, à superfície do corpo ciliar. Seus comprimentos abrangem distâncias que variam de 150 μm em camundongos a 1 mm em humanos. Coletivamente, essas fibras são conhecidas como o zonule de Zinn2, o zonule ciliar, ou simplesmente o zonule. Traumas oculares, doenças e certos distúrbios genéticos podem afetar a integridade das fibras zonulares3, resultando em sua eventual falha e perda de visão. Em camundongos, as fibras possuem um núcleo composto principalmente pela fibrillina-2 proteica, cercada por um manto rico em fibrillin-14. Embora as fibraszonulares sejam únicas aos olhos, elas possuem muitas semelhanças com as fibras ECM baseadas em elastina encontradas em outros lugares do corpo. Estes últimos são cobertos por um manto de fibrillina-15 e têm dimensões semelhantes às fibraszonulares6. Outras proteínas, como o fator de crescimento transformador latente β proteínas de ligação (LTBPs) e a glicoproteína associada à microfibril-1 (MAGP-1), são encontradas em associação com ambos os tipos de fibras7,8,9,10,11. O módulo elástico das fibraszonulares está na faixa de 0,18-1,50 MPa12,13,14,15,16, comparável ao das fibras à base de elastina (0,3-1,2 MPa)17. Essas semelhanças arquitetônicas e mecânicas nos levam a acreditar que qualquer visão sobre os papéis das proteínas associadas ao zonule pode ajudar a elucidar seus papéis em outras fibras elásticas ECM.
O principal objetivo do desenvolvimento do método descrito aqui é obter insights sobre o papel de proteínaszonulares específicas na progressão da doença ocular hereditária. A abordagem geral é comparar as propriedades viscoelásticas das fibraszonulares em camundongos do tipo selvagem com as de camundongos portadores de mutações direcionadas em genes que codificam proteínaszonulares. Embora vários métodos tenham sido utilizados anteriormente para medir as propriedades elasto-mecânicas das fibraszonulares, todos foram projetados para os olhos de animais muito maiores12,13,14,15,16. Como tais modelos não são geneticamente tratáveis; buscamos desenvolver um método experimental mais adequado aos pequenos e delicados olhos dos ratos.
O método que desenvolvemos para avaliar a viscoelasticidade das fibraszonulares do camundongo é uma técnica a que chamamos de ensaio de puxar para cima4,18, que é resumido visualmente na Figura 1. Uma descrição detalhada do método pull-up e a análise dos resultados são fornecidas abaixo. Começamos descrevendo a construção do aparelho, incluindo as peças tridimensionais (3D) impressas usadas no projeto. Em seguida, detalhamos o protocolo usado para a obtenção e preparação dos olhos para o experimento. Por fim, fornecemos instruções passo a passo sobre como obter dados para a determinação das propriedades viscoelásticas das fibras zonulares. Na seção Resultados Representativos, compartilhamos dados inéditos obtidos com nosso método sobre as propriedades viscoelásticas de fibras zonulares de camundongos sem MAGP-119, bem como um conjunto de controle obtido a partir de animais do tipo selvagem com correspondência etária. Por fim, concluímos com observações gerais sobre as vantagens e limitações do método, e sugestões de potenciais experimentos que possam elucidar como fatores ambientais e bioquímicos afetam as propriedades viscoelásticas das fibras ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
O zonule é um sistema ECM incomum onde as fibras são organizadas simetricamente e podem ser manipuladas de forma idêntica deslocando a lente ocular ao longo do eixo óptico. O espaço também pode ser facilmente acessado sem interrupção celular, permitindo que as fibras sejam estudadas em um ambiente próximo ao seu estado natal. A técnica de pull-up aproveita esta apresentação de ECM para manipular as fibras delicadas de camundongos, um sistema geneticamente tratável, e quantificar com precisão suas propriedad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01 EY029130 (S.B.) e P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 e pela Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.), a Fundação Marfan, e uma bolsa irrestrita ao Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais da Universidade de Washington de Pesquisa para Prevenir a Cegueira. J.R. também recebeu uma bolsa da Universidade de Ciências da Saúde e Farmácia em apoio a este projeto.
Materials
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
References
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