Preparación biológica y técnica mecánica para determinar las propiedades viscoelásticas de las fibras zonulares
Summary
El protocolo describe un método para el estudio de la viscoelasticidad de la matriz extracelular y su dependencia de la composición proteica o de factores ambientales. El sistema matricial objetivo es la zónula del ratón. El rendimiento del método se demuestra comparando el comportamiento viscoelástico de las fibras zonulares de tipo salvaje con las que carecen de glicoproteína-1 asociada a microfibrillas.
Abstract
La elasticidad es esencial para la función de tejidos como los vasos sanguíneos, los músculos y los pulmones. Esta propiedad se deriva principalmente de la matriz extracelular (ECM), la malla de proteínas que une células y tejidos. Cómo las propiedades elásticas de una red ecm se relacionan con su composición, y si las propiedades de relajación de la ECM juegan un papel fisiológico, son preguntas que aún no se han abordado por completo. Parte del desafío radica en la compleja arquitectura de la mayoría de los sistemas ECM y la dificultad para aislar los componentes ECM sin comprometer su estructura. Una excepción es la zónula, un sistema ecm que se encuentra en el ojo de los vertebrados. La zónula comprende fibras de cientos a miles de micrómetros de longitud que abarcan el espacio libre de células entre el cristalino y la pared del ojo. En este informe, describimos una técnica mecánica que aprovecha la estructura altamente organizada de la zónula para cuantificar sus propiedades viscoelásticas y determinar la contribución de los componentes proteicos individuales. El método consiste en la disección de un ojo fijo para exponer el cristalino y la zónula y emplea una técnica de pull-up que estira las fibras zonulares por igual mientras se controla su tensión. La técnica es relativamente barata pero lo suficientemente sensible como para detectar alteraciones en las propiedades viscoelásticas de las fibras zonulares en ratones que carecen de proteínas zonulares específicas o con el envejecimiento. Aunque el método presentado aquí está diseñado principalmente para estudiar el desarrollo ocular y la enfermedad, también podría servir como un modelo experimental para explorar preguntas más amplias sobre las propiedades viscoelásticas de las ECM elásticas y el papel de factores externos como la concentración iónica, la temperatura y las interacciones con las moléculas de señalización.
Introduction
El ojo de un vertebrado contiene una lente óptica viva que ayuda a enfocar las imágenes en la retina1. La lente está suspendida en el eje óptico por un sistema de delicadas fibras orientadas radialmente, como se ilustra en la Figura 1A. En un extremo, las fibras se adhieren al ecuador del cristalino y, en el otro, a la superficie del cuerpo ciliar. Sus longitudes abarcan distancias que van desde 150 μm en ratones hasta 1 mm en humanos. Colectivamente, estas fibras se conocen como la zónula de Zinn2, la zónula ciliar, o simplemente la zónula. El trauma ocular, la enfermedad y ciertos trastornos genéticos pueden afectar la integridad de las fibras zonulares3, lo que resulta en su eventual falla y la consiguiente pérdida de la visión. En ratones, las fibras tienen un núcleo compuesto principalmente por la proteína fibrilina-2, rodeada por un manto rico en fibrilina-14. Aunque las fibras zonulares son exclusivas del ojo, tienen muchas similitudes con las fibras ECM a base de elastina que se encuentran en otras partes del cuerpo. Estos últimos están cubiertos por un manto de fibrilina-15 y tienen dimensiones similares a las fibras zonulares6. Otras proteínas, como las proteínas de unión al factor de crecimiento β transformante latente (LTBP) y la glicoproteína-1 asociada a microfibrillas (MAGP-1), se encuentran en asociación con ambos tipos de fibras7,8,9,10,11. El módulo elástico de las fibras zonulares está en el rango de 0.18-1.50 MPa12,13,14,15,16, comparable al de las fibras a base de elastina (0.3-1.2 MPa)17. Estas similitudes arquitectónicas y mecánicas nos llevan a creer que cualquier conocimiento de los roles de las proteínas asociadas a las zónulas puede ayudar a dilucidar sus roles en otras fibras elásticas de ECM.
El objetivo principal del desarrollo del método descrito aquí es obtener información sobre el papel de las proteínas zonulares específicas en la progresión de la enfermedad ocular hereditaria. El enfoque general es comparar las propiedades viscoelásticas de las fibras zonulares en ratones de tipo salvaje con las de ratones portadores de mutaciones dirigidas en genes que codifican proteínas zonulares. Si bien anteriormente se han utilizado varios métodos para medir las propiedades elastomecánicas de las fibras zonulares, todos fueron diseñados para los ojos de animales mucho más grandes12,13,14,15,16. Como tales modelos no son genéticamente tratables; buscamos desarrollar un método experimental que se adaptara mejor a los ojos pequeños y delicados de los ratones.
El método que desarrollamos para evaluar la viscoelasticidad de las fibras zonulares de ratón es una técnica a la que nos referimos como el ensayo pull-up4,18, que se resume visualmente en la Figura 1. A continuación se proporciona una descripción detallada del método pull-up y el análisis de los resultados. Comenzamos describiendo la construcción del aparato, incluidas las piezas impresas en tres dimensiones (3D) utilizadas en el proyecto. A continuación, detallamos el protocolo utilizado para obtener y preparar los ojos para el experimento. Por último, proporcionamos instrucciones paso a paso sobre cómo obtener datos para la determinación de las propiedades viscoelásticas de las fibras zonulares. En la sección resultados representativos, compartimos datos no publicados obtenidos con nuestro método sobre las propiedades viscoelásticas de las fibras zonulares de ratones que carecen de MAGP-119, así como un conjunto de control obtenido de animales de tipo salvaje de la misma edad. Finalmente, concluimos con observaciones generales sobre las ventajas y limitaciones del método, y sugerencias para posibles experimentos que pueden dilucidar cómo los factores ambientales y bioquímicos afectan las propiedades viscoelásticas de las fibras ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
La zónula es un sistema ECM inusual donde las fibras están dispuestas simétricamente y pueden manipularse de manera idéntica desplazando la lente del ojo a lo largo del eje óptico. También se puede acceder fácilmente al espacio sin interrupción celular, lo que permite estudiar las fibras en un entorno cercano a su estado nativo. La técnica pull-up aprovecha esta presentación ECM para manipular las delicadas fibras de ratones, un sistema genéticamente tratable, y cuantificar con precisión sus propiedades mecá…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por NIH R01 EY029130 (S.B.) y P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 y la Fundación de Investigación Ines Mandl (R.P.M.), la Fundación Marfan, y una subvención sin restricciones al Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales de la Universidad de Washington de Investigación para Prevenir la Ceguera. J.R. también recibió una subvención de la Universidad de Ciencias de la Salud y Farmacia en apoyo de este proyecto.
Materials
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
References
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