İnsan Tümör Hücrelerinde ve Tümör-ksinografted Farelerde Makropinositoz Aracılı ATP İçselleştirme için Floresan Mikroskopi
Summary
Yüksek hücresel çözünürlüğe sahip bir ATP taşıyıcısı olan nonhidrolize floresan adenozin trifosfatın (ATP) içselleştirilmesini görselleştirmek için tekrarlanabilir bir yöntem geliştirdik. Yöntemimizi bağımsız in vitro ve in vivo tahlil-insan tümör hücre hatları ve insan tümör dokusu ile ksinografted immün yetmezlikli fareler kullanarak doğruladık.
Abstract
Hücre dışı ATP (eATP) de dahil olmak üzere adenozin trifosfatın (ATP) ilaç direnci, epitel-mezenkimal geçiş (EMT) ve metastaz gibi tümöregenezin çeşitli yönlerinde önemli roller oynadığı gösterilmiştir. İntratümoral eATP, konsantrasyonda normal dokulara göre 103 ila10 kat daha yüksektir. eATP, EMT indüksiyonu için pürinerjik sinyali etkinleştirmek için bir haberci olarak işlev görmekle birlikte, çok çeşitli biyolojik işlevleri yerine getirmek için belirli bir endositoz türü olan upregulated makropinositoz yoluyla kanser hücreleri tarafından içselleştirilir. Bu işlevler arasında ATP gerektiren biyokimyasal reaksiyonlara enerji sağlamak, sinyal transdüksiyon sırasında fosfat gruplarını bağışlamak ve transkripsiyonel bir kofaktör olarak gen ekspresyonunu kolaylaştırmak veya hızlandırmak saymaktadır. ATP hazır ve kanser ve diğer alanlardaki çalışmaları şüphesiz artacaktır. Bununla birlikte, eATP çalışması erken bir aşamada kalır ve eATP ve içselleştirilmiş hücre içi ATP tarafından oynanan önemli ve çok yönlü faaliyetler tam olarak çözülmeden çözülmemiş sorular cevapsız kalır.
Bu yazarların laboratuvarlarının bu erken eATP çalışmalarına katkıları arasında, eATP içselleştirme sürecini izlemek ve karakterize etmek için makropinositoz ve endositoz izleyicilerinin yanı sıra çeşitli endositoz inhibitörleri olarak hizmet veren yüksek ve düşük moleküler ağırlıklı floresan dekstrans ile birlikte hidrolize edilemeyen floresan ATP’nin mikroskobik görüntülemesi yer almaktadır. Bu görüntüleme yöntemi tümör hücre hatlarına ve insan kanseri tümörleri ile ksinografe edilmiş immün yetmez farelere, eATP içselleştirme in vitro ve in vivoincelemek için uygulanmıştır. Bu makalede, makropinositoz-/endositoz aracılı eATP içselleştirme testlerinin farklı sistemlerde başarıyla yapılabilmesi için test koşullarının değiştirilmesi ve ince ayarlanmasına vurgu yaparak bu in vitro ve in vivo protokoller açıklanmaktadır.
Introduction
İntratümoral hücre dışı (yani) besinlerin fırsatçı alımı son zamanlarda kanser metabolizması için önemli bir ayırt edici işaret olarak adlandırılmıştır1. Bu önemli besinlerden biri ATP’dir, çünkü ieATP konsantrasyonu normal dokularda bulunandan 103 ve10 4 kat daha yüksektir, birkaç yüz μM ila düşük mM 2,3,4,5aralığındadır. Önemli bir enerji ve sinyal molekülü olarak ATP, kanserli ve sağlıklı hücrelerde hücresel metabolizmada merkezi bir rol oynar6,7,8. Hücre dışı ATP sadece kanser hücresi büyümesinde yer almaz, aynı zamanda ilaç direncini de teşvik eder9. Atp’nin hidrotropik aktivite gibi daha önce tanınmayan işlevleri yakın zamanda tanımlanmıştır, böylece ALZHEIMER10gibi hastalıklara ATP katılımını bu işe bulaşmıştır. Gerçekten de, ATP ve kanser hücrelerindeki, sağlıklı hücrelerdeki ve diğer hastalıklı hücrelerdeki işlevlerini anlamamız tamamlanmaktan uzak görünüyor. Bununla birlikte, ATP’nin kararsızlığı ve hücrelerdeki yüksek ciro oranları nedeniyle, ATP’nin hücre zarı boyunca ve hücre içine hareketini izlemek teknik olarak zordur.
Bu sorunu gidermek ve bu araştırma alanının ihtiyacını gidermek için, hem in vitro hem de in vivo11 ,12’de, ATP’nin içselleştirilmesini görselleştirmek ve içselleştirilmiş ATP’nin hücre içi mekansal lokalizasyonunu gözlemlemek için sulandırılamaz floresan ATP’nin (NHF-ATP)(Şekil1)taşıyıcı olarak kullanıldığı bir yöntem geliştirilmiştir. . NHF-ATP’nin, hem kanser hücre hatlarında hem de immün yetmez farelerde ksinografe edilen insan tümör dokusunda hayvan hücre zarları boyunca ATP hareketini araştırmak için endojen ATP’nin yerini11,12‘ye koyduğu gösterilmiştir. Ayrıca, hücrelere makropinositoz inhibitörlerinin uygulanması eATP içselleştirmesini engelledi, eATP’nin hücre içi alımının makropinositotik bir mekanizma içerdiğini düşündürdü9,11,12. Bu protokol, hücreye özgü proteinlere karşı immünobaslı kolabelingine ve böylece hangi hücre tipinin NHF-ATP’yi içselleştirdiğine izin veriyor. In vivo tümör ksinograftları ve yüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak, NHF-ATP doku örneğinde ve hatta tek bir hücre içinde mekansal olarak görselleştirilebilir. Bu yöntemler ayrıca hücresel alım yüzdesi, makropinositotik vezikül sayısı ve içselleştirme kinetiği gibi nicel analize izin sağlar. Bu makalede, NHF-ATP’nin, tek başına veya endositoz-izleyici floresan dekstrans13 , 14,15,16ile birlikte çalışarak, hücrelerdeki içselleştirmeyi takiben ATP’nin içselleştirmesini ve hücre içi lokalizasyonunu incelemek için farklı deneysel ortamlarda nasıl kullanılabileceği ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Şekil 1: Yüksek moleküler ağırlık floresan dektran etiketli nonhidrolize floresan ATP ve tetrametrinrodamin yapıları. (A) NHF-ATP yapısı. (B) HMWFD’nin şematik gösterimi. Kısaltmalar: ATP = adenozin trifosfat; NHF-ATP = sulanamayan floresan ATP; TMR = tetrametilrhodamin; HMWFD = yüksek moleküler ağırlıklı floresan dektran. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sulandırılamaz ATP’nin hücresel içselleştirilmesinin mekansal, zamansal ve nicel analizi için bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntem, teknik talimat ve temsili veriler sağladığımız çeşitli tümörojenik modeller de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik sistemlerde kullanım için yaygın olarak uygulanabilir. In vivo ATP içselleştirme çalışmaları sırasında yorumlanabilir veriler elde etmek için (protokolün bölüm 4), intratümoral dektran enjeksiyonundan kriyo gömmeye kadar geçen d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kriyoteksiyon Ohio Üniversitesi Histopatoloji Çekirdeği’nde yerinde gerçekleştirildi. Bu çalışma kısmen C Nielsen’e başlangıç fonları (Ohio Üniversitesi Sanat ve Bilim Koleji) tarafından desteklendi; NIH, X Chen’e R15 CA242177-01 ve RSAC ödülü verir.
Materials
| A549 cells, human lung epithelial, carcinoma | National Cancer Institute | n/a | Less expensive source |
| Acetone | Fisher Scientific | S25904 | |
| Aluminum foil, Reynolds | Grainger | 6CHG6 | |
| Aqueous Mounting Medium, ProLong Gold Anti-fade Reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| ATP analog | Jena Biosciences | NK-101 | |
| Autoclave, sterilizer | Grainger | 33ZZ40 | |
| Blades, cryostat, high profile | C. L. Sturkey, Inc. | DT554550 | |
| Calipers, vernier | Grainger | 4KU77 | |
| Cell medium, Ham's Nutrient Mixture F12, serum-free | Millipore Sigma | 51651C-1000ML | |
| Centrifuge, refrigerated with swinging bucket rotor | Eppendorf | 5810R | |
| Chloroform | Acros Organics | 423555000 | |
| Conical tube, 15 mL | VWR | 21008-216 | |
| Conical tube, 50 mL | VWR | 21008-242 | |
| Coverslips, glass, 12 mm | Corning | 2975-245 | |
| Cryostat, Leica CM1950 | Leica Biosystems | CM1950 | |
| Delicate task wipe, Kim Wipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Dextran, Lysine fixable, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1818 | MW = 70,000, Tetramethylrhodamine |
| Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1819 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), serum-free | Fisher Scientific | 11885076 | |
| Dry ice | Local delivery | Custom order | |
| Epifluorescent imaging system, Nikon NiU and Nikon NIS Elements acquisition software | Nikon | Custom order | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| Forceps, Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Forceps, Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Gloves (small, medium, large) | Microflex | N191, N192, N193 | |
| Gloves, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (for handling dry ice) | Fisher Scientific | 19-046-563 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F EA | |
| Incubator, cell culture | Eppendorf | Galaxy 170 S | |
| Labelling tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Marking pen, Sharpie (ultra-fine) | Staples | 642736 | |
| Mice, immunodeficient (Nu/J) | Jackson Laboratory | 2019 | |
| Microcentrifuge, accuSpin Micro17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | |
| Microscope slide box | Fisher Scientific | 50-751-4983 | |
| Needle, 27 gauge | Becton-Dickinson | 752 0071 | |
| Paintbrush | Grainger | 39AL12 | |
| Paper towels | Staples | 33550 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 416785000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Perforated spoon, 15 mm diameter, 135 mm length | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6162 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | |
| Pipet tips (10 μL) | Fisher Scientific | 02-707-438 | |
| Pipet tips (200 μL) | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| Pipet tips (1000 μL) | Fisher Scientific | 02-707-403 | |
| Pipets, serological (10 mL) | VWR | 89130-910 | |
| Pippetor, Gilson P2 | Daigger | EF9930A | |
| Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL) | Daigger | EF9931A | |
| Platform shaker – orbital, benchtop | Cole-Parmer | EW-51710-23 | |
| Positively-charged microscope slides, Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Scalpel, size 10, Surgical Design, Inc. | Fisher Scientific | 22-079-707 | |
| Scissors, surgical – sharp, curved | Fine Science Tools | 14005-12 | |
| Software for image analysis, Nikon Elements | Nikon | Custom order | |
| Software for image analysis, ImageJ (FIJI) | National Institutes of Health | n/a | Download online (free) |
| Specimen disc 30 mm (chuck holder), cryostat accessory | Leica Biosystems | 14047740044 | |
| Staining tray, 245 mm BioAssay Dish | Corning | 431111 | |
| Syringe, 1 cc | Becton-Dickinson | 309623 | |
| Tape, laboratory, 19 mm width | Fisher Scientific | 15-901-5R | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tissue culture dish, 100 x 15 mm diameter | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Tissue culture flask, 225 cm2 | ThermoFisher | 159933 | |
| Tissue culture plate, 24-well | Becton-Dickinson | 353226 | |
| Tissue embedding mold, stainless steel | Tissue Tek | 4161 | |
| Tissue Freezing Medium, Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fisher Scientific | 4585 | |
| Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.25% | Gibco | 25200072 | |
| Water bath, Precision GP 2S | ThermoFisher | TSGP2S |
References
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The emerging hallmarks of cancer metabolism. Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).
- Pellegatti, P., et al. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. 3, 25992008 (2008).
- Falzoni, S., Donvito, G., Di Virgilio, F. Detecting adenosine triphosphate in the pericellular space. Interface Focus. 3 (3), 20120101 (2013).
- Michaud, M., et al. Autophagy-dependent anticancer immune responses induced by chemotherapeutic agents in mice. Science. 334, 1573-1577 (2011).
- Wilhelm, K., et al. Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R. Nature Medicine. 16, 1434-1438 (2010).
- Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
- Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 85-95 (2011).
- Chen, X., Qian, Y., Wu, S. The Warburg effect: evolving interpretations of an established concept. Free Radical Biology & Medicine. 79, 253-263 (2015).
- Wang, X., et al. Extracellular ATP, as an energy and phosphorylating molecule, induces different types of drug resistances in cancer cells through ATP internalization and intracellular ATP level increase. Oncotarget. 8 (5), 87860-87877 (2017).
- Patel, A., et al. ATP as a biological hydrotrope. Science. 356, 753-756 (2017).
- Qian, Y., et al. Extracellular ATP is internalized by macropinocytosis and induces intracellular ATP increase and drug resistance in cancer cells. Cancer Letters. 351, 242-251 (2014).
- Qian, Y., Wang, X., Li, Y., Cao, Y., Chen, X. Extracellular ATP a new player in cancer metabolism: NSCLC cells internalize ATP in vitro and in vivo using multiple endocytic mechanisms. Molecular Cancer Research. 14, 1087-1096 (2016).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
- Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
- Yanagawa, Y., Matsumoto, M., Togashi, H. Enhanced dendritic cell antigen uptake via alpha2 adrenoceptor-mediated PI3K activation following brief exposure to noradrenaline. Journal of Immunology. 185, 5762-5768 (2010).
- Hoppe, H. C., et al. Antimalarial quinolines and artemisinin inhibit endocytosis in Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 48, 2370-2378 (2004).
- Chaudry, I. H. Does ATP cross the cell plasma membrane. Yale Journal of Biology & Medicine. 55, 1-10 (1982).
- Pant, H. C., Terakawa, S., Yoshioka, T., Tasaki, I., Gainer, H. Evidence for the utilization of extracellular [gamma-32P]ATP for the phosphorylation of intracellular proteins in the squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 582, 107-114 (1979).
- Chaudry, I. H., Baue, A. E. Further evidence for ATP uptake by rat tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 628, 336-342 (1980).
- Koppenol, W. H., Bounds, P. L., Dang, C. V. Otto Warburg’s contributions to current concepts of cancer metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 325-337 (2011).
- Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes & Development. 26, 877-890 (2012).
- Israelsen, W. J., Vander Heiden, M. G. ATP consumption promotes cancer metabolism. Cell. 143, 669-671 (2010).
- Koster, J. C., Permutt, M. A., Nichols, C. G. Diabetes and insulin secretion: the ATP-sensitive K+ channel (K ATP) connection. Diabetes. 54, 3065-3072 (2005).
- Szendroedi, J., et al. Muscle mitochondrial ATP synthesis and glucose transport/phosphorylation in type 2 diabetes. PLoS Medicine. 4, 154 (2007).
- Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).
