Флуоресцентная микроскопия для интернализации АТФ, опосредованной макропиноцитозом в опухолевых клетках человека и опухоле-ксенотрансплантированных мышах
Summary
Мы разработали воспроизводимый метод визуализации интернализации негидролизуемого флуоресцентного аденозинтрифосфата (АТФ), суррогата АТФ, с высоким клеточным разрешением. Мы подтвердили наш метод, используя независимые анализы in vitro и in vivo – клеточные линии опухоли человека и иммунодефицитные мыши, ксенотрансплантированные опухолевой тканью человека.
Abstract
Было показано, что аденозинтрифосфат (АТФ), включая внеклеточную АТФ (эАТФ), играет значительную роль в различных аспектах опухолевого генеза, таких как лекарственная устойчивость, эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМТ) и метастазирование. Внутриопухолевая эАТФ в 10-3-10-4 раза выше по концентрации, чем в нормальных тканях. В то время как eATP функционирует как мессенджер для активации пуринергической сигнализации для индукции EMT, он также интернализуется раковыми клетками через повышенный макропиноцитоз, специфический тип эндоцитоза, для выполнения широкого спектра биологических функций. Эти функции включают в себя обеспечение энергией биохимических реакций, требующих АТФ, донорство фосфатных групп во время трансдукции сигнала и облегчение или ускорение экспрессии генов в качестве транскрипционного кофактора. АТФ легко доступен, и его изучение в раке и других областях, несомненно, увеличится. Тем не менее, исследование eATP остается на ранней стадии, и нерешенные вопросы остаются без ответа, прежде чем важные и универсальные действия, выполняемые eATP и интернализованной внутриклеточной АТФ, могут быть полностью разгаданы.
Вклад лабораторий этих авторов в эти ранние исследования eATP включает микроскопическую визуализацию негидролизуемых флуоресцентных АТФ в сочетании с высоко- и низкомолекулярным флуоресцентным декстраном, которые служат индикаторами макропиноцитоза и эндоцитоза, а также различными ингибиторами эндоцитоза для мониторинга и характеристики процесса интернализации eATP. Этот метод визуализации был применен к опухолевым клеточным линиям и иммунодефицитным мышам, ксенотрансплантированным с раковыми опухолями человека, для изучения интернализации eATP in vitro и in vivo. В данной работе описываются эти протоколы in vitro и in vivo с акцентом на модификацию и тонкую настройку условий анализа, чтобы макропиноцитоз-/эндоцитоз-опосредованные eATP анализы интернализации eATP могли быть успешно выполнены в различных системах.
Introduction
Оппортунистическое поглощение внутриопухолевых внеклеточных (т.е.) питательных веществ недавно было названо ключевой отличительной чертой метаболизма рака1. Одним из таких важных питательных веществ является АТФ, так как концентрация т.е. АТФ в 103 и10 4 раза выше, чем та, что содержится в нормальных тканях, в диапазоне от нескольких сотен мкМ до низкихмМ 2,3,4,5. Как ключевая энергетическая и сигнальная молекула, АТФ играет центральную роль в клеточном метаболизме в раковых и здоровых клетках6,7,8. Внеклеточный АТФ не только участвует в росте раковых клеток, но и способствует лекарственной устойчивости9. Недавно были выявлены ранее непризнанные функции АТФ, такие как гидротропная активность, что связано с участием АТФ в таких заболеваниях, как болезнь Альцгеймера10. Действительно, кажется, что наше понимание АТФ и его функций в раковых клетках, здоровых клетках и других больных клетках далеко не полное. Однако из-за нестабильности АТФ и высокой скорости оборота в клетках технически сложно контролировать движение АТФ через клеточную мембрану и в клетку.
Для решения этой проблемы и восполнения потребности данной области исследований был разработан метод, в котором негидролизуемая флуоресцентная АТФ (NHF-АТФ)(Рисунок 1)использовалась в качестве суррогата для визуализации интернализации АТФ и наблюдения внутриклеточной пространственной локализации интернализованной АТФ, как in vitro, так и in vivo11,12 . Было продемонстрировано, что NHF-АТФ заменяет эндогенную АТФ для исследования движения АТФ через клеточные мембраны животных, как в линиях раковых клеток, так и в опухолевой ткани человека, ксенотрансплантированной на иммунодефицитных мышах11,12. Более того, введение ингибиторов макропиноцитоза клеткам блокировало интернализацию eATP, предполагая, что внутриклеточное поглощение eATP включает макропиноцитотический механизм9,11,12. Этот протокол допускает иммунобабелирование против клеточных специфических белков и, таким образом, идентификацию того, какой тип клеток интернализует NHF-АТФ. Используя in vivo опухолевые ксенотрансплантаты и микроскопию высокого разрешения, NHF-АТФ может быть визуализирована пространственно по всему образцу ткани и даже в пределах одной клетки. Эти методы также позволяют проводить количественный анализ, такой как процент поглощения клеток, количество макропиноцитарных везикул и кинетика интернализации. В данной работе подробно описывается, как NHF-АТФ, работающий отдельно или вместе с флуоресцентным декстрансом 13, 14, 15, 16 эндоцитозом или вместе с эндоцитозом-индикаторным декстрансом13,14,15,16,может быть использован в различных экспериментальных условиях для изучения интернализации АТФ и внутриклеточной локализации после интернализации в клетках.
Рисунок 1:Структуры негидролизуемых флуоресцентных АТФ и тетраметилродамина, меченных высокомолекулярным флуоресцентным декстраном. (А)Структура NHF-АТФ. (B)Схематическое изображение HMWFD. Сокращения: АТФ = аденозинтрифосфат; NHF-АТФ = негидролизуемый флуоресцентный АТФ; TMR = тетраметилродамин; HMWFD = высокомолекулярный флуоресцентный декстран. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Разработан метод пространственного, временного и количественного анализа клеточной интернализации негидролизуемых АТФ. Этот метод широко применим для использования в различных биологических системах, включая различные опухолевые модели, для которых мы предоставляем технические ин…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Криосекционирование проводилось на месте в гистопатологическом ядре Университета Огайо. Эта работа была частично поддержана стартовыми фондами (Ohio University College of Arts & Sciences) для C Nielsen; Грант NIH R15 CA242177-01 и награда RSAC X Chen.
Materials
| A549 cells, human lung epithelial, carcinoma | National Cancer Institute | n/a | Less expensive source |
| Acetone | Fisher Scientific | S25904 | |
| Aluminum foil, Reynolds | Grainger | 6CHG6 | |
| Aqueous Mounting Medium, ProLong Gold Anti-fade Reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| ATP analog | Jena Biosciences | NK-101 | |
| Autoclave, sterilizer | Grainger | 33ZZ40 | |
| Blades, cryostat, high profile | C. L. Sturkey, Inc. | DT554550 | |
| Calipers, vernier | Grainger | 4KU77 | |
| Cell medium, Ham's Nutrient Mixture F12, serum-free | Millipore Sigma | 51651C-1000ML | |
| Centrifuge, refrigerated with swinging bucket rotor | Eppendorf | 5810R | |
| Chloroform | Acros Organics | 423555000 | |
| Conical tube, 15 mL | VWR | 21008-216 | |
| Conical tube, 50 mL | VWR | 21008-242 | |
| Coverslips, glass, 12 mm | Corning | 2975-245 | |
| Cryostat, Leica CM1950 | Leica Biosystems | CM1950 | |
| Delicate task wipe, Kim Wipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Dextran, Lysine fixable, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1818 | MW = 70,000, Tetramethylrhodamine |
| Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1819 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), serum-free | Fisher Scientific | 11885076 | |
| Dry ice | Local delivery | Custom order | |
| Epifluorescent imaging system, Nikon NiU and Nikon NIS Elements acquisition software | Nikon | Custom order | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| Forceps, Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Forceps, Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Gloves (small, medium, large) | Microflex | N191, N192, N193 | |
| Gloves, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (for handling dry ice) | Fisher Scientific | 19-046-563 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F EA | |
| Incubator, cell culture | Eppendorf | Galaxy 170 S | |
| Labelling tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Marking pen, Sharpie (ultra-fine) | Staples | 642736 | |
| Mice, immunodeficient (Nu/J) | Jackson Laboratory | 2019 | |
| Microcentrifuge, accuSpin Micro17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | |
| Microscope slide box | Fisher Scientific | 50-751-4983 | |
| Needle, 27 gauge | Becton-Dickinson | 752 0071 | |
| Paintbrush | Grainger | 39AL12 | |
| Paper towels | Staples | 33550 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 416785000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Perforated spoon, 15 mm diameter, 135 mm length | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6162 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | |
| Pipet tips (10 μL) | Fisher Scientific | 02-707-438 | |
| Pipet tips (200 μL) | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| Pipet tips (1000 μL) | Fisher Scientific | 02-707-403 | |
| Pipets, serological (10 mL) | VWR | 89130-910 | |
| Pippetor, Gilson P2 | Daigger | EF9930A | |
| Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL) | Daigger | EF9931A | |
| Platform shaker – orbital, benchtop | Cole-Parmer | EW-51710-23 | |
| Positively-charged microscope slides, Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Scalpel, size 10, Surgical Design, Inc. | Fisher Scientific | 22-079-707 | |
| Scissors, surgical – sharp, curved | Fine Science Tools | 14005-12 | |
| Software for image analysis, Nikon Elements | Nikon | Custom order | |
| Software for image analysis, ImageJ (FIJI) | National Institutes of Health | n/a | Download online (free) |
| Specimen disc 30 mm (chuck holder), cryostat accessory | Leica Biosystems | 14047740044 | |
| Staining tray, 245 mm BioAssay Dish | Corning | 431111 | |
| Syringe, 1 cc | Becton-Dickinson | 309623 | |
| Tape, laboratory, 19 mm width | Fisher Scientific | 15-901-5R | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tissue culture dish, 100 x 15 mm diameter | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Tissue culture flask, 225 cm2 | ThermoFisher | 159933 | |
| Tissue culture plate, 24-well | Becton-Dickinson | 353226 | |
| Tissue embedding mold, stainless steel | Tissue Tek | 4161 | |
| Tissue Freezing Medium, Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fisher Scientific | 4585 | |
| Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.25% | Gibco | 25200072 | |
| Water bath, Precision GP 2S | ThermoFisher | TSGP2S |
References
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The emerging hallmarks of cancer metabolism. Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).
- Pellegatti, P., et al. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. 3, 25992008 (2008).
- Falzoni, S., Donvito, G., Di Virgilio, F. Detecting adenosine triphosphate in the pericellular space. Interface Focus. 3 (3), 20120101 (2013).
- Michaud, M., et al. Autophagy-dependent anticancer immune responses induced by chemotherapeutic agents in mice. Science. 334, 1573-1577 (2011).
- Wilhelm, K., et al. Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R. Nature Medicine. 16, 1434-1438 (2010).
- Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
- Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 85-95 (2011).
- Chen, X., Qian, Y., Wu, S. The Warburg effect: evolving interpretations of an established concept. Free Radical Biology & Medicine. 79, 253-263 (2015).
- Wang, X., et al. Extracellular ATP, as an energy and phosphorylating molecule, induces different types of drug resistances in cancer cells through ATP internalization and intracellular ATP level increase. Oncotarget. 8 (5), 87860-87877 (2017).
- Patel, A., et al. ATP as a biological hydrotrope. Science. 356, 753-756 (2017).
- Qian, Y., et al. Extracellular ATP is internalized by macropinocytosis and induces intracellular ATP increase and drug resistance in cancer cells. Cancer Letters. 351, 242-251 (2014).
- Qian, Y., Wang, X., Li, Y., Cao, Y., Chen, X. Extracellular ATP a new player in cancer metabolism: NSCLC cells internalize ATP in vitro and in vivo using multiple endocytic mechanisms. Molecular Cancer Research. 14, 1087-1096 (2016).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
- Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
- Yanagawa, Y., Matsumoto, M., Togashi, H. Enhanced dendritic cell antigen uptake via alpha2 adrenoceptor-mediated PI3K activation following brief exposure to noradrenaline. Journal of Immunology. 185, 5762-5768 (2010).
- Hoppe, H. C., et al. Antimalarial quinolines and artemisinin inhibit endocytosis in Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 48, 2370-2378 (2004).
- Chaudry, I. H. Does ATP cross the cell plasma membrane. Yale Journal of Biology & Medicine. 55, 1-10 (1982).
- Pant, H. C., Terakawa, S., Yoshioka, T., Tasaki, I., Gainer, H. Evidence for the utilization of extracellular [gamma-32P]ATP for the phosphorylation of intracellular proteins in the squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 582, 107-114 (1979).
- Chaudry, I. H., Baue, A. E. Further evidence for ATP uptake by rat tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 628, 336-342 (1980).
- Koppenol, W. H., Bounds, P. L., Dang, C. V. Otto Warburg’s contributions to current concepts of cancer metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 325-337 (2011).
- Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes & Development. 26, 877-890 (2012).
- Israelsen, W. J., Vander Heiden, M. G. ATP consumption promotes cancer metabolism. Cell. 143, 669-671 (2010).
- Koster, J. C., Permutt, M. A., Nichols, C. G. Diabetes and insulin secretion: the ATP-sensitive K+ channel (K ATP) connection. Diabetes. 54, 3065-3072 (2005).
- Szendroedi, J., et al. Muscle mitochondrial ATP synthesis and glucose transport/phosphorylation in type 2 diabetes. PLoS Medicine. 4, 154 (2007).
- Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).
