Fluoreszenzmikroskopie für ATP-Internalisierung, vermittelt durch Makropinozytose in menschlichen Tumorzellen und tumor-xenografierten Mäusen
Summary
Wir haben eine reproduzierbare Methode entwickelt, um die Internalisierung von nicht hydrolysierbarem fluoreszierendem Adenosintriphosphat (ATP), einem ATP-Surrogat, mit hoher zellulärer Auflösung sichtbar zu machen. Wir validierten unsere Methode mit unabhängigen In-vitro- und In-vivo-Assays – humane Tumorzelllinien und immundefiziente Mäuse, die mit menschlichem Tumorgewebe xenotransplantiert wurden.
Abstract
Es hat sich gezeigt, dass Adenosintriphosphat (ATP), einschließlich extrazellulärer ATP (eATP), eine bedeutende Rolle in verschiedenen Aspekten der Tumorgenese spielt, wie z. B. Arzneimittelresistenz, epithelial-mesenchymaler Übergang (EMT) und Metastasierung. Intratumorales eATP ist 103 bis 104 mal höher in der Konzentration als in normalem Gewebe. Während eATP als Botenstoff fungiert, um die purinerge Signalgebung für die EMT-Induktion zu aktivieren, wird es auch von Krebszellen durch hochregulierte Makropinozytose, eine spezifische Art der Endozytose, internalisiert, um eine Vielzahl von biologischen Funktionen auszuführen. Zu diesen Funktionen gehören die Bereitstellung von Energie für ATP-erfordernde biochemische Reaktionen, die Spende von Phosphatgruppen während der Signaltransduktion und die Erleichterung oder Beschleunigung der Genexpression als transkriptioneller Cofaktor. ATP ist leicht verfügbar, und seine Studie in Krebs und anderen Bereichen wird zweifellos zunehmen. Die eATP-Studie befindet sich jedoch noch in einem frühen Stadium, und ungelöste Fragen bleiben unbeantwortet, bevor die wichtigen und vielseitigen Aktivitäten von eATP und internalisierter intrazellulärer ATP vollständig entschlüsselt werden können.
Die Beiträge der Labors dieser Autoren zu diesen frühen eATP-Studien umfassen die mikroskopische Bildgebung von nicht hydrolysierbarem fluoreszierendem ATP in Verbindung mit hoch- und niedermolekularem fluoreszierendem Dextrans, die als Makropinozytose- und Endozytose-Tracer dienen, sowie verschiedene Endozytoseinhibitoren, um den eATP-Internalisierungsprozess zu überwachen und zu charakterisieren. Diese Bildgebungsmodalität wurde auf Tumorzelllinien und auf immundefiziente Mäuse angewendet, die mit menschlichen Krebstumoren xenotransplantiert wurden, um die eATP-Internalisierung in vitro und in vivozu untersuchen. Dieses Papier beschreibt diese in vitro und in vivo Protokolle, mit einem Schwerpunkt auf der Modifikation und Feinabstimmung der Assay-Bedingungen, so dass die Makropinozytose-/Endozytose-vermittelten eATP-Internalisierungsassays erfolgreich in verschiedenen Systemen durchgeführt werden können.
Introduction
Die opportunistische Aufnahme von intratumoralen extrazellulären (dh) Nährstoffen wurde kürzlich zu einem Schlüsselmerkmal für den Krebsstoffwechsel ernannt1. Einer dieser wichtigen Nährstoffe ist ATP, da die Konzentration von ieATP 103 und 104 mal höher ist als die in normalem Gewebe, im Bereich von mehreren hundert μM bis zu niedrigem mM2,3,4,5. Als wichtiges Energie- und Signalmolekül spielt ATP eine zentrale Rolle im Zellstoffwechsel in krebsartigen und gesunden Zellen6,7,8. Extrazelluläres ATP ist nicht nur am Wachstum von Krebszellen beteiligt, sondern fördert auch die Arzneimittelresistenz9. Bisher nicht erkannte Funktionen von ATP, wie die hydrotrope Aktivität, wurden kürzlich identifiziert, was eine ATP-Beteiligung an Krankheiten wie Alzheimer10impliziert. Tatsächlich scheint es, dass unser Verständnis von ATP und seinen Funktionen in Krebszellen, gesunden Zellen und anderen erkrankten Zellen bei weitem nicht vollständig ist. Aufgrund der Instabilität von ATP und der hohen Fluktuationsraten in den Zellen ist es jedoch technisch schwierig, die Bewegung von ATP über die Zellmembran und in die Zelle zu überwachen.
Um dieses Problem anzugehen und den Bedarf dieses Forschungsbereichs zu decken, wurde eine Methode entwickelt, bei der nichthydrolysierbare fluoreszierende ATP (NHF-ATP) (Abbildung 1) als Surrogat verwendet wurde, um die Internalisierung von ATP zu visualisieren und die intrazelluläre räumliche Lokalisierung von internalisiertem ATP sowohl in vitro als auch in vivozu beobachten11,12 . Es wurde gezeigt, dass NHF-ATP endogenes ATP ersetzt, um die ATP-Bewegung über tierische Zellmembranen zu untersuchen, sowohl in Krebszelllinien als auch in menschlichem Tumorgewebe, das an immundefizienten Mäusen xenotransplantiert wurde11,12. Darüber hinaus blockierte die Verabreichung von Makropinozytoseinhibitoren an Zellen die eATP-Internalisierung, was darauf hindeutet, dass die intrazelluläre Aufnahme von eATP einen makropinozytotischen Mechanismus beinhaltet9,11,12. Dieses Protokoll erlaubt eine immunbasierte Comarkierung gegen zellspezifische Proteine und damit die Identifizierung, welcher Zelltyp NHF-ATP internalisiert. Mit In-vivo-Tumor-Xenotransplantaten und hochauflösender Mikroskopie kann NHF-ATP räumlich über die Gewebeprobe und sogar innerhalb einer einzelnen Zelle sichtbar gemacht werden. Diese Methoden ermöglichen auch quantitative Analysen, wie z. B. den Prozentsatz der zellulären Aufnahme, die Anzahl der makropinozytotischen Vesikel und die Internalisierungskinetik. Dieser Artikel beschreibt detailliert, wie NHF-ATP allein oder zusammen mit dem endozytose-tracer fluoreszierenden Dextrans13,14,15,16, in verschiedenen experimentellen Umgebungen verwendet werden kann, um die Internalisierung und intrazelluläre Lokalisation von ATP nach Internalisierung in Zellen zu untersuchen.
Abbildung 1: Strukturen von nicht hydrolysierbarem fluoreszierendem ATP und Tetramethylrhodamin markiertem hochmolekularem Fluoreszenzdextran. (A) Struktur von NHF-ATP. (B) Schematische Darstellung der HMWFD. Abkürzungen: ATP = Adenosintriphosphat; NHF-ATP = nicht hydrolysierbare fluoreszierbares ATP; TMR = Tetramethylrhodamin; HMWFD = hochmolekulares fluoreszierendes Dextran. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es wurde eine Methode zur räumlichen, zeitlichen und quantitativen Analyse der zellulären Internalisierung von nicht hydrolysierbarem ATP entwickelt. Diese Methode ist breit anwendbar für den Einsatz in verschiedenen biologischen Systemen, einschließlich verschiedener tumorigener Modelle, für die wir technische Anweisungen und repräsentative Daten bereitstellen. Um interpretierbare Daten während in vivo ATP-Internalisierungsstudien (Abschnitt 4 des Protokolls) zu erhalten, ist es von entscheidender Bedeut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Kryosektion wurde vor Ort am Ohio University Histopathology Core durchgeführt. Diese Arbeit wurde teilweise durch Start-up-Fonds (Ohio University College of Arts & Sciences) an C Nielsen unterstützt; NIH gewähren R15 CA242177-01 und RSAC Award an X Chen.
Materials
| A549 cells, human lung epithelial, carcinoma | National Cancer Institute | n/a | Less expensive source |
| Acetone | Fisher Scientific | S25904 | |
| Aluminum foil, Reynolds | Grainger | 6CHG6 | |
| Aqueous Mounting Medium, ProLong Gold Anti-fade Reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| ATP analog | Jena Biosciences | NK-101 | |
| Autoclave, sterilizer | Grainger | 33ZZ40 | |
| Blades, cryostat, high profile | C. L. Sturkey, Inc. | DT554550 | |
| Calipers, vernier | Grainger | 4KU77 | |
| Cell medium, Ham's Nutrient Mixture F12, serum-free | Millipore Sigma | 51651C-1000ML | |
| Centrifuge, refrigerated with swinging bucket rotor | Eppendorf | 5810R | |
| Chloroform | Acros Organics | 423555000 | |
| Conical tube, 15 mL | VWR | 21008-216 | |
| Conical tube, 50 mL | VWR | 21008-242 | |
| Coverslips, glass, 12 mm | Corning | 2975-245 | |
| Cryostat, Leica CM1950 | Leica Biosystems | CM1950 | |
| Delicate task wipe, Kim Wipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Dextran, Lysine fixable, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1818 | MW = 70,000, Tetramethylrhodamine |
| Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1819 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), serum-free | Fisher Scientific | 11885076 | |
| Dry ice | Local delivery | Custom order | |
| Epifluorescent imaging system, Nikon NiU and Nikon NIS Elements acquisition software | Nikon | Custom order | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| Forceps, Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Forceps, Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Gloves (small, medium, large) | Microflex | N191, N192, N193 | |
| Gloves, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (for handling dry ice) | Fisher Scientific | 19-046-563 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F EA | |
| Incubator, cell culture | Eppendorf | Galaxy 170 S | |
| Labelling tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Marking pen, Sharpie (ultra-fine) | Staples | 642736 | |
| Mice, immunodeficient (Nu/J) | Jackson Laboratory | 2019 | |
| Microcentrifuge, accuSpin Micro17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | |
| Microscope slide box | Fisher Scientific | 50-751-4983 | |
| Needle, 27 gauge | Becton-Dickinson | 752 0071 | |
| Paintbrush | Grainger | 39AL12 | |
| Paper towels | Staples | 33550 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 416785000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Perforated spoon, 15 mm diameter, 135 mm length | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6162 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | |
| Pipet tips (10 μL) | Fisher Scientific | 02-707-438 | |
| Pipet tips (200 μL) | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| Pipet tips (1000 μL) | Fisher Scientific | 02-707-403 | |
| Pipets, serological (10 mL) | VWR | 89130-910 | |
| Pippetor, Gilson P2 | Daigger | EF9930A | |
| Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL) | Daigger | EF9931A | |
| Platform shaker – orbital, benchtop | Cole-Parmer | EW-51710-23 | |
| Positively-charged microscope slides, Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Scalpel, size 10, Surgical Design, Inc. | Fisher Scientific | 22-079-707 | |
| Scissors, surgical – sharp, curved | Fine Science Tools | 14005-12 | |
| Software for image analysis, Nikon Elements | Nikon | Custom order | |
| Software for image analysis, ImageJ (FIJI) | National Institutes of Health | n/a | Download online (free) |
| Specimen disc 30 mm (chuck holder), cryostat accessory | Leica Biosystems | 14047740044 | |
| Staining tray, 245 mm BioAssay Dish | Corning | 431111 | |
| Syringe, 1 cc | Becton-Dickinson | 309623 | |
| Tape, laboratory, 19 mm width | Fisher Scientific | 15-901-5R | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tissue culture dish, 100 x 15 mm diameter | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Tissue culture flask, 225 cm2 | ThermoFisher | 159933 | |
| Tissue culture plate, 24-well | Becton-Dickinson | 353226 | |
| Tissue embedding mold, stainless steel | Tissue Tek | 4161 | |
| Tissue Freezing Medium, Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fisher Scientific | 4585 | |
| Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.25% | Gibco | 25200072 | |
| Water bath, Precision GP 2S | ThermoFisher | TSGP2S |
References
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