인간 종양 세포 및 종양-xenografted 마우스에 있는 매크로 피노세포증에 의해 중재된 ATP 내재화를 위한 형광 현미경 검사법
Summary
우리는 높은 세포 분해능을 가진 ATP 대리인 비수성 아데노신 삼위산염(ATP)의 내재화를 시각화하는 재현 가능한 방법을 개발했습니다. 우리는 독립적인 체외 및 생체 내 분석-인간 종양 세포주 및 면역결핍 마우스 를 사용하여 인간 종양 조직과 이식된 우리의 방법을 검증했습니다.
Abstract
세포외 ATP(eATP)를 포함한 아데노신 트리호스페이트(ATP)는 약물 내성, 상피-중간엽 전이(EMT) 및 전이와 같은 종양 발생의 다양한 양상에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 종양 내 eATP는 정상 조직보다 농도가 103 ~ 104 배 높다. eATP는 EMT 유도를 위한 순수성 신호 전달을 활성화하기 위한 메신저로서 기능하지만, 또한 특정 유형의 내분세포증인 고세포증을 통해 암세포에 의해 내면화되어 다양한 생물학적 기능을 수행한다. 이러한 기능에는 ATP가 요구하는 생화학 반응에 에너지를 제공하고, 신호 변환 중에 인산염 그룹을 기증하고, 전사 보조 인자로서 유전자 발현을 촉진하거나 가속화하는 것이 포함됩니다. ATP는 쉽게 사용할 수 있으며 암 및 기타 분야에서의 연구는 의심 할 여지없이 증가 할 것입니다. 그러나 eATP 연구는 초기 단계에 남아 있으며 eATP와 내부화된 세포내 ATP가 연주하는 중요하고 다재다능한 활동이 완전히 해명되기 전에 해결되지 않은 질문은 여전히 답이 없습니다.
이러한 초기 eATP 연구에 대한 이러한 저자의 실험실의 기여는 비 가수분해성 형광 ATP의 현미경 이미징을 포함하며, 고분자 및 저분자 형광 덱스트랜스와 결합하여 거시피노세포증 및 내세포 증산 억제제뿐만 아니라 다양한 내세포증 억제제역할을 하며, 내부화를 감시하고 특성화합니다. 이러한 이미징 양식은 종양 세포주 및 면역형 마우스에 적용되었으며, 인간 암 종양과 이식된 이노노이식, 체외 및 생체 내eATP 내재화를 연구하였다. 이 백서는 이러한 체외 및 생체 내 프로토콜을 설명하며, 매크로피노시토시스/내세포 매개 eATP 내분비분석 분석이 다른 시스템에서 성공적으로 수행될 수 있도록 분석 조건을 수정및 미세 조정하는 데 중점을 두고 있습니다.
Introduction
종양 외 세포 (즉) 영양소의 기회적 섭취는 최근 암 대사1의핵심 특징으로 명명되었습니다. 이러한 중요한 영양소 중 하나는 ATP이며, ieATP의 농도는 정상 조직에서 발견되는 것보다 103 및 104 배 더 높으며, 수백 μM에서 낮은 mM2,3,4,5에있다. 주요 에너지 및 신호 분자로서 ATP는 암과 건강한 세포에서 세포 대사에 중심적인 역할을 한다6,7,8. 세포외 ATP는 암세포 성장에 관여할 뿐만 아니라 약물 내성9도촉진한다. 이전에는 수중성 활동과 같은 ATP의 인식되지 않은 기능이 확인되어 알츠하이머10과같은 질병에 ATP가 관여하는 것을 연루시킨다. 실제로, ATP의 우리의 이해와 암세포에 있는 그것의 기능, 건강한 세포 및 그밖 병된 세포는 완전하지 않습니다 보입니다. 그러나, ATP의 불안정성과 세포에 있는 높은 이직률 때문에, 세포막을 통해 그리고 세포로 ATP의 운동을 감시하는 것은 기술적으로 도전적입니다.
이러한 문제점을 해결하고 이 연구 영역의 필요성을 채우기 위해, ATP의 내재화를 시각화하고 생체 내 및 생체내 11,12의 내재된 ATP의 세포 내 공간 국소화를 관찰하기 위해 비수성 형광 ATP(NHF-ATP)(도1)를대리로 사용하는 방법이개발되었다. . NHF-ATP는 암 세포주 및 면역형 마우스11,12에이식된 인간 종양 조직 에서 동물 세포막을 통해 ATP 운동을 조사하기 위해 내인성 ATP를 대체하는 것으로 입증되었다. 더욱이, 세포에 대식세포 억제제를 투여하여 eATP 내산화를 막아, eATP의 세포내 섭취가9,11,12의대식세포메커니즘을포함한다는 것을 시사한다. 이 프로토콜은 세포 특정 단백질에 대한 면역 기반 공동 라벨링을 허용하고 따라서 어떤 세포 유형이 NHF-ATP를 내면화시키는지 식별합니다. 생체 종양 이종이이식 및 고해상도 현미경 검사법을 사용하여 NHF-ATP는 조직 샘플 전반에 걸쳐 심지어 단일 세포 내에서도 공간적으로 시각화될 수 있습니다. 또한 이러한 방법은 세포 섭취 비율, 거시세포 소포 수 및 내재화 운동과 같은 정량적 분석을 허용합니다. 이 논문은 NHF-ATP가 세포 내재화에 따라 ATP의 내재화 및 세포 내 국소화를 연구하기 위해 다양한 실험 환경에서 어떻게 사용하거나 내분비 추적형 형광덱스트랜스(13,14,15,16)와함께 작업하는지 자세히 설명합니다.
그림 1: 비가수성 형광 ATP 및 테트라메틸lrhodamine의 구조는 높은 분자량 형광 dextran을 표시. (A)NHF-ATP의 구조. (B)HMWFD의 회로도 표현. 약어: ATP = 아데노신 트리호스페이트; NHF-ATP = 비가수성 형광 ATP; TMR = 테트라메틸lrhodamine; HMWFD = 고분자 량 형광 드엑스트라른. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
비수성 ATP의 세포 내산화의 공간적, 시간적 및 정량적 분석을 위해 개발되었다. 이 방법은 기술 교육 및 대표 데이터를 제공하는 다양한 종양 유발 모델을 포함한 다양한 생물학적 시스템에서 사용하기 에 광범위하게 적용됩니다. 생체 내 ATP 내재화 연구(프로토콜의 섹션 4)에서 해석 가능한 데이터를 획득하려면 종양 내 주사에서 극저온-포함으로 경과된 실험 시간을 제한하는 것이 중요합…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저온절균은 오하이오 대학 조직 병리학 코어에서 현장에서 수행되었습니다. 이 작품은 C 닐슨에 창업 기금 (오하이오 대학 예술 과학 대학)에 의해 부분적으로 지원되었다; NIH는 R15 CA242177-01 및 RSAC 상을 X Chen에 부여합니다.
Materials
| A549 cells, human lung epithelial, carcinoma | National Cancer Institute | n/a | Less expensive source |
| Acetone | Fisher Scientific | S25904 | |
| Aluminum foil, Reynolds | Grainger | 6CHG6 | |
| Aqueous Mounting Medium, ProLong Gold Anti-fade Reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| ATP analog | Jena Biosciences | NK-101 | |
| Autoclave, sterilizer | Grainger | 33ZZ40 | |
| Blades, cryostat, high profile | C. L. Sturkey, Inc. | DT554550 | |
| Calipers, vernier | Grainger | 4KU77 | |
| Cell medium, Ham's Nutrient Mixture F12, serum-free | Millipore Sigma | 51651C-1000ML | |
| Centrifuge, refrigerated with swinging bucket rotor | Eppendorf | 5810R | |
| Chloroform | Acros Organics | 423555000 | |
| Conical tube, 15 mL | VWR | 21008-216 | |
| Conical tube, 50 mL | VWR | 21008-242 | |
| Coverslips, glass, 12 mm | Corning | 2975-245 | |
| Cryostat, Leica CM1950 | Leica Biosystems | CM1950 | |
| Delicate task wipe, Kim Wipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Dextran, Lysine fixable, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1818 | MW = 70,000, Tetramethylrhodamine |
| Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1819 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), serum-free | Fisher Scientific | 11885076 | |
| Dry ice | Local delivery | Custom order | |
| Epifluorescent imaging system, Nikon NiU and Nikon NIS Elements acquisition software | Nikon | Custom order | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| Forceps, Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Forceps, Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Gloves (small, medium, large) | Microflex | N191, N192, N193 | |
| Gloves, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (for handling dry ice) | Fisher Scientific | 19-046-563 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F EA | |
| Incubator, cell culture | Eppendorf | Galaxy 170 S | |
| Labelling tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Marking pen, Sharpie (ultra-fine) | Staples | 642736 | |
| Mice, immunodeficient (Nu/J) | Jackson Laboratory | 2019 | |
| Microcentrifuge, accuSpin Micro17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | |
| Microscope slide box | Fisher Scientific | 50-751-4983 | |
| Needle, 27 gauge | Becton-Dickinson | 752 0071 | |
| Paintbrush | Grainger | 39AL12 | |
| Paper towels | Staples | 33550 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 416785000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Perforated spoon, 15 mm diameter, 135 mm length | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6162 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | |
| Pipet tips (10 μL) | Fisher Scientific | 02-707-438 | |
| Pipet tips (200 μL) | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| Pipet tips (1000 μL) | Fisher Scientific | 02-707-403 | |
| Pipets, serological (10 mL) | VWR | 89130-910 | |
| Pippetor, Gilson P2 | Daigger | EF9930A | |
| Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL) | Daigger | EF9931A | |
| Platform shaker – orbital, benchtop | Cole-Parmer | EW-51710-23 | |
| Positively-charged microscope slides, Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Scalpel, size 10, Surgical Design, Inc. | Fisher Scientific | 22-079-707 | |
| Scissors, surgical – sharp, curved | Fine Science Tools | 14005-12 | |
| Software for image analysis, Nikon Elements | Nikon | Custom order | |
| Software for image analysis, ImageJ (FIJI) | National Institutes of Health | n/a | Download online (free) |
| Specimen disc 30 mm (chuck holder), cryostat accessory | Leica Biosystems | 14047740044 | |
| Staining tray, 245 mm BioAssay Dish | Corning | 431111 | |
| Syringe, 1 cc | Becton-Dickinson | 309623 | |
| Tape, laboratory, 19 mm width | Fisher Scientific | 15-901-5R | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tissue culture dish, 100 x 15 mm diameter | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Tissue culture flask, 225 cm2 | ThermoFisher | 159933 | |
| Tissue culture plate, 24-well | Becton-Dickinson | 353226 | |
| Tissue embedding mold, stainless steel | Tissue Tek | 4161 | |
| Tissue Freezing Medium, Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fisher Scientific | 4585 | |
| Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.25% | Gibco | 25200072 | |
| Water bath, Precision GP 2S | ThermoFisher | TSGP2S |
References
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