Microscopía de fluorescencia para internalización de ATP mediada por macropinocitosis en células tumorales humanas y ratones xenoinjertados con tumores
Summary
Desarrollamos un método reproducible para visualizar la internalización del trifosfato de adenosina fluorescente no hidrolizable (ATP), un sustituto de ATP, con alta resolución celular. Validamos nuestro método utilizando ensayos independientes in vitro e in vivo: líneas celulares tumorales humanas y ratones inmunodeficientes xenoinjertados con tejido tumoral humano.
Abstract
Se ha demostrado que el trifosfato de adenosina (ATP), incluido el ATP extracelular (eATP), desempeña un papel importante en varios aspectos de la tumorigénesis, como la resistencia a los medicamentos, la transición epitelial-mesenquimal (EMT) y la metástasis. La eATP intratumoral es de 10a 3 a 104 veces mayor en concentración que en los tejidos normales. Si bien eATP funciona como un mensajero para activar la señalización purinérgica para la inducción de EMT, también es internalizado por las células cancerosas a través de la macropinocitosis regulada al alza, un tipo específico de endocitosis, para realizar una amplia variedad de funciones biológicas. Estas funciones incluyen proporcionar energía a las reacciones bioquímicas que requieren ATP, donar grupos fosfato durante la transducción de señales y facilitar o acelerar la expresión génica como cofactor transcripcional. El ATP está fácilmente disponible, y su estudio en el cáncer y otros campos sin duda aumentará. Sin embargo, el estudio eATP se encuentra en una etapa temprana, y las preguntas no resueltas siguen sin respuesta antes de que las actividades importantes y versátiles desempeñadas por eATP y ATP intracelular internalizado puedan desentrañarse por completo.
Las contribuciones de los laboratorios de estos autores a estos primeros estudios de eATP incluyen imágenes microscópicas de ATP fluorescente no hidrolizable, junto con dextrans fluorescentes de alto y bajo peso molecular, que sirven como trazadores de macropinocitosis y endocitosis, así como varios inhibidores de endocitosis, para monitorear y caracterizar el proceso de internalización de eATP. Esta modalidad de imagen se aplicó a líneas celulares tumorales y a ratones inmunodeficientes, xenoinjertados con tumores de cáncer humano, para estudiar la internalización de eATP in vitro e in vivo. Este artículo describe estos protocolos in vitro e in vivo, con énfasis en la modificación y el ajuste fino de las condiciones del ensayo para que los ensayos de internalización eATP mediados por macropinocitosis / endocitosis se puedan realizar con éxito en diferentes sistemas.
Introduction
La absorción oportunista de nutrientes extracelulares intratumorales (es decir) ha sido nombrada recientemente un sello distintivo clave para el metabolismo del cáncer1. Uno de estos nutrientes importantes es el ATP, ya que la concentración de ieATP es 103 y 104 veces mayor que la que se encuentra en los tejidos normales, en el rango de varios cientos de μM a mM bajo2,3,4,5. Como molécula clave de energía y señalización, el ATP juega un papel central en el metabolismo celular en células cancerosas y sanas6,7,8. El ATP extracelular no solo está involucrado en el crecimiento de células cancerosas, sino que también promueve la resistencia a los medicamentos9. Recientemente se han identificado funciones previamente no reconocidas del ATP, como la actividad hidrotrópica, lo que implica la participación del ATP en enfermedades como el Alzheimer10. De hecho, parece que nuestra comprensión del ATP y sus funciones en las células cancerosas, las células sanas y otras células enfermas está lejos de ser completa. Sin embargo, debido a la inestabilidad del ATP y las altas tasas de renovación en las células, es técnicamente difícil monitorear el movimiento del ATP a través de la membrana celular y hacia la célula.
Para abordar este problema y satisfacer la necesidad de esta área de investigación, se desarrolló un método en el que se utilizó ATP fluorescente no hidrolizable (NHF-ATP)(Figura 1)como sustituto para visualizar la internalización del ATP y observar la localización espacial intracelular del ATP internalizado, tanto in vitro como in vivo11,12 . Se ha demostrado que el NHF-ATP sustituye al ATP endógeno para investigar el movimiento del ATP a través de las membranas celulares animales, tanto en líneas celulares cancerosas como en tejido tumoral humano xenoinjertado en ratones inmunodeficientes11,12. Además, la administración de inhibidores de la macropinocitosis a las células bloqueó la internalización de eATP, lo que sugiere que la absorción intracelular de eATP implica un mecanismo macropinocitótico9,11,12. Este protocolo permite el colabeling de base inmunocomprimida contra proteínas específicas de la célula y, por lo tanto, la identificación de qué tipo de célula internaliza el NHF-ATP. Utilizando xenoinjertos tumorales in vivo y microscopía de alta resolución, el NHF-ATP se puede visualizar espacialmente a través de la muestra de tejido e incluso dentro de una sola célula. Estos métodos también permiten el análisis cuantitativo, como el porcentaje de absorción celular, el número de vesículas macropinocitóticas y la cinética de internalización. Este artículo describe en detalle cómo el NHF-ATP, trabajando solo o junto con endocitosis-trazador fluorescente dextrans13,14,15,16, se puede utilizar en diferentes entornos experimentales para estudiar la internalización y localización intracelular de ATP, después de la internalización en las células.
Figura 1: Estructuras de ATP fluorescente no hidrolizable y tetrametilrodamina marcadas con dextrano fluorescente de alto peso molecular. (A) Estructura de NHF-ATP. (B) Representación esquemática de HMWFD. Abreviaturas: ATP = trifosfato de adenosina; NHF-ATP = ATP fluorescente no hidrolizable; TMR = tetrametilrodamina; HMWFD = dextrano fluorescente de alto peso molecular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se desarrolló un método para el análisis espacial, temporal y cuantitativo de la internalización celular de ATP no hidrolizable. Este método es ampliamente aplicable para su uso en diversos sistemas biológicos, incluidos varios modelos tumorigénicos, para los cuales proporcionamos instrucción técnica y datos representativos. Para adquirir datos interpretables durante los estudios de internalización de ATP in vivo (sección 4 del protocolo), es fundamental limitar el tiempo experimental transcurrido des…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La crioseccionación se realizó in situ en el Núcleo de Histopatología de la Universidad de Ohio. Este trabajo fue apoyado en parte por fondos de puesta en marcha (Ohio University College of Arts & Sciences) a C Nielsen; Concesión de los NIH R15 CA242177-01 y concesión de RSAC a X Chen.
Materials
| A549 cells, human lung epithelial, carcinoma | National Cancer Institute | n/a | Less expensive source |
| Acetone | Fisher Scientific | S25904 | |
| Aluminum foil, Reynolds | Grainger | 6CHG6 | |
| Aqueous Mounting Medium, ProLong Gold Anti-fade Reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| ATP analog | Jena Biosciences | NK-101 | |
| Autoclave, sterilizer | Grainger | 33ZZ40 | |
| Blades, cryostat, high profile | C. L. Sturkey, Inc. | DT554550 | |
| Calipers, vernier | Grainger | 4KU77 | |
| Cell medium, Ham's Nutrient Mixture F12, serum-free | Millipore Sigma | 51651C-1000ML | |
| Centrifuge, refrigerated with swinging bucket rotor | Eppendorf | 5810R | |
| Chloroform | Acros Organics | 423555000 | |
| Conical tube, 15 mL | VWR | 21008-216 | |
| Conical tube, 50 mL | VWR | 21008-242 | |
| Coverslips, glass, 12 mm | Corning | 2975-245 | |
| Cryostat, Leica CM1950 | Leica Biosystems | CM1950 | |
| Delicate task wipe, Kim Wipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Dextran, Lysine fixable, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1818 | MW = 70,000, Tetramethylrhodamine |
| Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1819 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), serum-free | Fisher Scientific | 11885076 | |
| Dry ice | Local delivery | Custom order | |
| Epifluorescent imaging system, Nikon NiU and Nikon NIS Elements acquisition software | Nikon | Custom order | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| Forceps, Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Forceps, Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Gloves (small, medium, large) | Microflex | N191, N192, N193 | |
| Gloves, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (for handling dry ice) | Fisher Scientific | 19-046-563 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F EA | |
| Incubator, cell culture | Eppendorf | Galaxy 170 S | |
| Labelling tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Marking pen, Sharpie (ultra-fine) | Staples | 642736 | |
| Mice, immunodeficient (Nu/J) | Jackson Laboratory | 2019 | |
| Microcentrifuge, accuSpin Micro17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | |
| Microscope slide box | Fisher Scientific | 50-751-4983 | |
| Needle, 27 gauge | Becton-Dickinson | 752 0071 | |
| Paintbrush | Grainger | 39AL12 | |
| Paper towels | Staples | 33550 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 416785000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Perforated spoon, 15 mm diameter, 135 mm length | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6162 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | |
| Pipet tips (10 μL) | Fisher Scientific | 02-707-438 | |
| Pipet tips (200 μL) | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| Pipet tips (1000 μL) | Fisher Scientific | 02-707-403 | |
| Pipets, serological (10 mL) | VWR | 89130-910 | |
| Pippetor, Gilson P2 | Daigger | EF9930A | |
| Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL) | Daigger | EF9931A | |
| Platform shaker – orbital, benchtop | Cole-Parmer | EW-51710-23 | |
| Positively-charged microscope slides, Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Scalpel, size 10, Surgical Design, Inc. | Fisher Scientific | 22-079-707 | |
| Scissors, surgical – sharp, curved | Fine Science Tools | 14005-12 | |
| Software for image analysis, Nikon Elements | Nikon | Custom order | |
| Software for image analysis, ImageJ (FIJI) | National Institutes of Health | n/a | Download online (free) |
| Specimen disc 30 mm (chuck holder), cryostat accessory | Leica Biosystems | 14047740044 | |
| Staining tray, 245 mm BioAssay Dish | Corning | 431111 | |
| Syringe, 1 cc | Becton-Dickinson | 309623 | |
| Tape, laboratory, 19 mm width | Fisher Scientific | 15-901-5R | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tissue culture dish, 100 x 15 mm diameter | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Tissue culture flask, 225 cm2 | ThermoFisher | 159933 | |
| Tissue culture plate, 24-well | Becton-Dickinson | 353226 | |
| Tissue embedding mold, stainless steel | Tissue Tek | 4161 | |
| Tissue Freezing Medium, Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fisher Scientific | 4585 | |
| Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.25% | Gibco | 25200072 | |
| Water bath, Precision GP 2S | ThermoFisher | TSGP2S |
References
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