Burada, genetiği değiştirilmiş fare modeli kaynaklı tümörlerde in vivo embriyonik öldürücü olan gen nakavtlarını gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz ve daha sonra nakavtın tümör büyümesi, proliferasyon, sağkalım, göç, invazyon ve transkriptom in vitro ve in vivo üzerindeki etkisini değerlendiriyoruz.
İnsan kanserlerinde anahtar proteinleri tam olarak hedef alan yeni ilaçların geliştirilmesi, kanser terapötiklerini temelden değiştirmektedir. Bununla birlikte, bu ilaçların kullanılabilmesi için önce, hedef proteinlerinin spesifik kanser türlerinde terapötik hedefler olarak doğrulanması gerekir. Bu doğrulama genellikle, genetiği değiştirilmiş bir fare (GEM) kanser modelinde aday terapötik hedefi kodlayan geni nakavt ederek ve bunun tümör büyümesi üzerindeki etkisinin ne olduğunu belirleyerek gerçekleştirilir. Ne yazık ki, geleneksel nakavtlarda embriyonik öldürücülük ve koşullu nakavtlarda mozaiklik gibi teknik konular genellikle bu yaklaşımı sınırlar. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, bir GEM modelinde üretilen malign periferik sinir kılıfı tümörlerinin (MPNST’ler) kısa süreli kültürlerinde ilgi çekici bir floks embriyonik ölümcül genin ablatasyonuna yönelik bir yaklaşım geliştirilmiştir.
Bu yazıda, uygun genotipe sahip bir fare modelinin nasıl oluşturulacağı, bu hayvanlardan kısa süreli tümör kültürlerinin nasıl türetileceği ve daha sonra Cre rekombinaz ve gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP) eksprese eden adenoviral bir vektör kullanarak floklu embriyonik ölümcül genin nasıl ablate edileceği açıklanmaktadır. Daha sonra floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanılarak adenovirüs ile dönüştürülen hücrelerin saflaştırılması ve gen ablasyonunun hücresel proliferasyon, canlılık, transkriptom ve ortotopik allogreft büyümesi üzerindeki etkilerinin ölçülmesi detaylandırılır. Bu metodolojiler, terapötik hedefleri in vitro ve in vivo olarak tanımlamak ve doğrulamak için etkili ve genellenebilir bir yaklaşım sağlar. Bu yaklaşımlar aynı zamanda in vitro büyüme artefaktları azalmış düşük pasajlı tümör türevi hücrelerin yenilenebilir bir kaynağını sağlar. Bu, hedeflenen genin biyolojik rolünün, sekretomun aracılık ettiği göç, istila, metastaz ve hücreler arası iletişim gibi çeşitli biyolojik süreçlerde incelenmesini sağlar.
Son yirmi yıldan önce, insan kanserlerinin tedavisi, DNA’ya zarar vererek veya DNA sentezini inhibe ederek hızla çoğalan hücresel popülasyonları geniş ölçüde hedef alan radyoterapi ve kemoterapötik ajanlara dayanıyordu. Bu yaklaşımlar kanser hücresi büyümesini inhibe etmesine rağmen, bağırsak epitel hücreleri ve saç folikülü hücreleri gibi normal hızla çoğalan hücre tipleri üzerinde zararlı yan etkileri de vardı. Daha yakın zamanlarda, kanser tedavisi, bireysel bir hastanın neoplazmının büyümesi için kritik öneme sahip sinyal yolaklarındaki proteinleri tam olarak hedef alan kemoterapötik ajanları kullanmaya başlamıştır. Genellikle “Hassas Tıp” olarak adlandırılan bu yaklaşım, monoklonal antikorların ve küçük moleküler inhibitörlerin sürekli genişleyen bir repertuarının geliştirilmesine yol açmıştır. Bu ajanlar, tümör hücrelerinin proliferasyonunu ve sağkalımını etkili bir şekilde inhibe ederken, konvansiyonel kemoterapötik ajanlar ve radyoterapi ile görülen normal hücre tipleri üzerindeki zararlı yan etkilerden kaçınır. İnsan kanserlerinin tedavisinde kullanılan monoklonal antikorlar en yaygın olarak büyüme faktörü reseptörleri 1 (örneğin, membranı kapsayan reseptör tirozin kinazların geniş ailesi) ve immün yanıt modülatörleri2 (örneğin, programlanmış hücre ölüm proteini 1, programlanmış ölümligandı 1) gibi hücre yüzey moleküllerini hedef alır. Küçük moleküler inhibitörler, hücre yüzey proteinlerini veya hücre içinde bulunan sinyal proteinlerini inhibe edebilir3. Bununla birlikte, bu yeni terapötik ajanları etkili bir şekilde kullanmak için, belirli bir kanserin, aday bir terapötik ajan tarafından hedeflenen moleküle bağımlı olduğu tespit edilmelidir.
Bu yeni terapötik ajanların daha odaklanmış etkileri olmasına rağmen, birçoğu hala birden fazla proteinin etkisini inhibe etmektedir. Ek olarak, belirli bir proteini hedeflemek için değişen etkinlik ve özgüllüğe sahip çoklu ajanlar sıklıkla mevcuttur. Sonuç olarak, klinik öncesi araştırmalar sırasında, bir aday proteini terapötik bir hedef olarak doğrulamak için genetik ablasyon gibi ek yaklaşımlar kullanmak akıllıca olacaktır. Bir proteini terapötik bir hedef olarak doğrulamak için özellikle yararlı bir yaklaşım, aday proteini kodlayan geni, spesifik kanser türünü geliştiren genetiği değiştirilmiş bir hayvan modelinde ablatmaktır. Bu yaklaşım, boş mutasyona sahip fareler (doğal bir mutasyon, genetiği değiştirilmiş bir boş mutasyon [bir “nakavt”] veya bir gen tuzağı tarafından tanıtılan boş bir mutasyon) mevcutsa ve fareler yetişkinliğe kadar yaşayabilirse, nispeten basit olabilir. Ne yazık ki, bu kriterleri karşılayan null mutasyona sahip fareler genellikle mevcut değildir, çünkü tipik olarak null mutasyon embriyonik olarak veya doğum sonrası yaşamın ilk günlerinde ölümle sonuçlanır. Bu durumda, tümör tipini geliştirmeye eğilimli fareler, bunun yerine, ilgilenilen genin kilit segmentlerinin loxP bölgeleri (“floksed”) tarafından kuşatıldığı farelere geçebilir; bu, genin tümör hücrelerine Cre rekombinazını ifade eden bir transgen (koşullu nakavt) sokularak ablatlanmasına izin verir. Bu yaklaşım çeşitli avantajlar sağlar. İlk olarak, tümörde eksprese edilen, ancak geleneksel nakavtlarda ölüme yol açan hücre tipinde ifade edilmeyen bir Cre sürücüsü mevcutsa, bu yaklaşım potansiyel olarak aday terapötik hedefi doğrulayabilir. İkincisi, aday proteini tümör hücrelerinde kodlayan geni ablukaya almak, ancak tümörle ilişkili fibroblastlar veya bağışıklık hücreleri gibi diğer tümör içi elementlerde değil, araştırmacının terapötik hedefin hücre özerk ve hücre dışı özerk etkilerini ayırt etmesini sağlar. Son olarak, tamoksifen ile indüklenebilen bir Cre sürücüsü (CreERT2), araştırmacının tümör gelişiminde farklı aşamalarda ilgilendiği geni silmesine ve aday terapötik ajanın etkili olma ihtimalinin en yüksek olduğu pencereyi tanımlamasına izin verir.
Ne yazık ki, GEM modellerinde ortaya çıkan tümörlerde koşullu nakavt kullanımını sınırlayabilecek teknik sorunlar da vardır. Örneğin, tümör hücrelerinde eksprese edilen ve yaşam için gerekli olan normal hücrelerde gen delesyonunu önleyen bir Cre sürücüsü mevcut olmayabilir. Küçümsenebilecek bir başka konu, Cre ve CreERT2 sürücülerinin farelerde flokslu alelleri sıklıkla değişken bir şekilde ablate etmesi ve GEM kanserindeki boş mutasyon için mozaikçiliğe neden olmasıdır. Bu meydana geldiğinde, hedeflenen genin ablatlanmadığı tümör hücreleri hızla çoğalmaya devam edecek ve tümör hücrelerini ablatlanmış alellerle aşırı büyütecektir. Cre sürücü hatlarındaki mozaiklik, hedeflenen soyda her yerde bulunmayan Cre ekspresyonu ve Cre ekspresyonu4’ten bağımsız bireysel hücrelerde başarısız rekombinasyon nedeniyle ortaya çıkabilir. Bu, hücre tipine bağımlı olan ve deneysel tasarım ve veri yorumlama sırasında göz önünde bulundurulması gereken Cre sürücülerinin bilinen bir olgusudur. Mozaisizm, nakavtın etkisini maskeleyebilir ve bir araştırmacının, ilgilenilen genin tümör hücresi proliferasyonu ve / veya hayatta kalması için gerekli olmadığı ve dolayısıyla geçerli bir terapötik hedef olmadığı sonucuna varmasına neden olabilir.
Bu sorunların birçoğu, reseptör tirozin kinaz erbB4’ün MPNST hücrelerinde potansiyel bir terapötik hedef olup olmadığını belirlemeye çalışan önceki bir çalışmada karşılaşılmıştır5. Bu çalışmalarda, Schwann hücresine özgü miyelin proteini sıfır promotörünün (P 0-GGFβ3 fareleri) kontrolü altında nötregülin-1 (NRG1) izoform glial büyüme faktörü-β3’ü (GGFβ3) kodlayan bir transgeni ifade eden fareler kullanılmıştır. P 0-GGFβ3 fareleri, otozomal dominant tümör duyarlılık sendromu nörofibromatozis tip 1 (NF1)6 olan hastalarda görülen nörofibrom patogenezi ve pleksiform nörofibrom-MPNST progresyonu süreçlerini özetleyen bir süreçle MPNST olmaya ilerleyen multipleksiform nörofibromlar geliştirir. Trp53 null mutasyonlu farelere geçildiğinde, ortaya çıkan P 0-GGFβ3; Trp53+/– fareler, cis-Nf1+/-‘de görüldüğü gibi MPNST’ler de novo geliştirir; Trp53+/- fareler.
Bu MPNST’ler, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) derece II’den insanlarda görülen DSÖ derece IV lezyonlarına ilerlemeyi özetlemektedir7. P 0-GGFβ3 farelerde, MPNST’ler trigeminal sinirde (% 58) ve spinal dorsal sinir köklerinde (% 68) önceden var olan pleksiform nörofibromlarda ortaya çıkar7; P 0-GGFβ3’te ortaya çıkan MPNST’ler; Trp53+/- fareler oldukça benzer bir dağılıma sahiptir. İnsanlarda, MPNST’ler en sık siyatik sinirde ortaya çıkar, bunu brakiyal pleksus, spinal sinir kökleri, vagus, femoral, medyan, sakral pleksus, popliteal obturator ve posterior tibial ve ulnar sinirlerizler 8. Bu GEM modellerindeki bu tümör dağılımı, insanlarda görülenlerden biraz farklıdır. Bununla birlikte, P 0-GGFβ3 ve P0-GGFβ3’te ortaya çıkan MPNST’ler; Trp53+/– fareler histolojik olarak insan MPNST’leri ile aynıdır, insan MPNST’lerinde görülen aynı mutasyonların çoğunu taşır ve NF1 hastalarında görülen nörofibrom-MPNST progresyon sürecini özetler. P 0-GGFβ3 veya P0-GGFβ3 üretimi; Trp53+/– Erbb4–/- olan fareler, iki Erbb4 null aleli olan fareler, kardiyak defektlere sekonder 10.5 embriyonik günde uteroda öldüğü için mümkün değildi9. Çünkü kalp-spesifik bir Erbb4 transgeni (α-miyozin ağır zinciri (MHC)-Erbb4) ekleyerek kalpteki Erbb4 ekspresyonunu kurtarmak, uygulanabilir Erbb4-/- fareler 10, karmaşık bir P 0-GGFβ3 ile farelerin oluşumu ile sonuçlanır; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- genotipi denendi.
Bununla birlikte, çiftleşmeler beklenen Mendel oranlarında fare üretmedi, bu da istenen genotipin zararlı olduğunu gösterdi. Bu nedenle, P 0-GGFβ3 üretimi; Trp53+/- Flokslanmış Erbb4 alelleri11 ve CreERT2 sürücüsü olan fareler, bu farelerde ortaya çıkan MPNST’lerde Erbb4’ün silinmesine izin vermeye çalışıldı. Bu hayvanlarda, bozulmamış Erbb4 alellerine sahip çok sayıda tümör hücresi hala mevcuttu (mozaiklik). Gözlenen mozaisizm, verimsiz tamoksifen dağıtımından kaynaklanabilir ve bu da doku içinde rekombinasyon etkinliğinde farklılıklara neden olabilir. Spontan kompansatör mekanizmaların olasılığı, Erbb4 ekspresyonu gereksinimini atlayarak tamoksifen aracılı rekombinasyonda mozaisizme daha fazla katkıda bulunabilir. Trp53 kaybının, tümör hücrelerini, verilerin yorumlanmasını karıştırabilecek ek spontan “izin verilen” mutasyonlara duyarlı hale getirmesi mümkündür. Erbb4-bozulmamış MPNST hücrelerinin diğer tümör hücrelerinde Erbb4’ün ablatlanmasının sonuçlarını maskelemesi muhtemel göründüğü için, bu yaklaşım terk edildi.
Bu engeller, Cre rekombinaz ve eGFP’yi eksprese eden bir adenovirüs kullanarak çok erken geçiş MPNST hücrelerinde Erbb4’ü ablatlamak için bir metodolojinin geliştirilmesine yol açtı. Bu hücreler, ablatlanmış Erbb4 geni için mozaisizmi belirgin şekilde azaltan FACS kullanılarak enfekte olmayan hücrelerden ayrılabilir. Aşağıda, bunu başarmak için kullanılan yöntemler, gen ablasyonunun in vitro ve in vivo etkilerini değerlendirmek için kullanılan yöntemlerle birlikte açıklanmaktadır. Aşağıdaki protokol, in vivo allogreft tümör büyüme değerlendirmesinden önce ex vivo eksizyon için ilgi çekici embriyonik ölümcül genlerin floklu alellerini taşıyan tümörleri veren tümör taşıyan farelerin nasıl üretileceğine bir örnektir. Bu, Erbb4 ablasyonunun tümör hücresi proliferasyonu, sağkalım ve gen ekspresyonu in vitro ve ortotopik allogreftlerde proliferasyon, sağkalım ve anjiyogenez üzerindeki etkisini analiz etmek için kullanılan yaklaşımların bir tanımını içerir.
Burada sunulan ayrıntılı yöntemler, MPNST’lerin GEM modeli kullanılarak geliştirilmiştir. Bununla birlikte, ilgilenilen tümör dokusu bireysel hücrelere dağılabilirse, bu metodolojiler GEM’lerde ortaya çıkan çeşitli tümör tipleri için kolayca uyarlanabilir. Floksed alelin i) tümörleri taramak için yeterli fareler elde etmeyi zorlaştırabilecek sağkalımın azalmasına veya ii) yeterli tümör taşıyan farelerin elde edilmesini zorlaştırabilecek tümör gecikmesinin artmasına neden olmadığınd…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Hastalıklar ve İnme Enstitüsü (R01 NS048353, R01 NS109655), Ulusal Kanser Enstitüsü (R01 CA122804), Savunma Bakanlığı (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 ve W81XWH-15-1-0193) ve Çocuk Tümörü Vakfı (2014-04-001 ve 2015-05-007) tarafından desteklenmiştir.
Ad5CMV-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-4 | |
Ad5CMVCre-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-1174 | |
alexa 568 secondary antibody | Thermo/Fisher | GaR A11036 | |
Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics | Bioconductor | http://www.bioconductor.org | alternative statistical analysis tool used for step 4.4 |
CD31 | Abcam | ab28364 | |
Celigo Image Cytometer | Nexcelom Bioscience | N/A | |
Cell Stripper | Corning | 25-056-Cl | mixture of chelators |
DAB staining kit | Vector Labs | MP-7800 | |
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) | DAVID | https://david.ncifcrf.gov | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
DMEM | Corning | 15-013-Cl | |
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR) | Thermo/Fisher | EP0701 and K1072 | |
erbB4 antibodies | Santa Cruz | sc-284 | |
erbB4 antibodies | Abcam | ab35374 | |
erbB4 antibodies | Millipore | HFR1: 05-1133 | |
FACS Sorter | BD Biosciences | Aria II | |
Forskolin | Sigma | F6886 | |
GenomeSpace Tools and Data Sources | GenomeSpace | https://genomespace.org/support/tools/ | general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5 |
Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool | Gorilla | N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
GSEA Gene Set Enrichment Analysis | Broad Institute | N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice | Envigo (Previously Harlan Labs) | 69 | |
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer) | Illumina | Hi Seq 2500 | DNA sequencer used for step 4.2 |
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis | DNAStar LaserGene software | N/A | software statistical and normalization analysis used for step 4.4 |
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly | software alignment used for step 4.3 | N/A | software alignment used for step 4.3 |
Matrigel, low growth factor basement membrane matrix | Corning | 354230 | |
NRG1-beta | In house | Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF). | |
Nuclear Stain Hoeschst 33342 | Thermo | 62249 | |
Panther Gene Ontology Classification System | Panther | http://pantherdb.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
Partek (BWA aligner and analyzer) | Partek, Ver 7 | N/A | software alignment and statistical/normalization used for step 4.3 |
Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product. | |
Propidium Iodine | Fisher | 51-351-0 | |
Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays | R&D Systems | ARY003B | |
Real time glo | Promega | G9712 | bioluminescent cell viability assay |
ToppGene Suite | ToppGene | https://toppgene.cchmc.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent) | Invitrogen | 15596026 | |
Tyramide Signal Amplification Kit | Perkin Elmer | NEL721001EA |