تحديد وظائف الجينات في تكوين الأورام عن طريق الاستئصال خارج الجسم الحي للأليلات المفلطحة في الخلايا السرطانية الخبيثة للغمد العصبي المحيطي
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لإجراء الضربات القاضية الجينية القاتلة جنينيا في الجسم الحي في الأورام المشتقة من نموذج الفئران المهندسة وراثيا ، ثم تقييم تأثير الضربة القاضية على نمو الورم ، والانتشار ، والبقاء على قيد الحياة ، والهجرة ، والغزو ، والنسخ في المختبر وفي الجسم الحي.
Abstract
إن تطوير عقاقير جديدة تستهدف بدقة البروتينات الرئيسية في السرطانات البشرية يغير بشكل أساسي علاجات السرطان. ومع ذلك ، قبل استخدام هذه الأدوية ، يجب التحقق من صحة البروتينات المستهدفة كأهداف علاجية في أنواع محددة من السرطان. غالبا ما يتم إجراء هذا التحقق من الصحة عن طريق ضرب الجين الذي يشفر الهدف العلاجي المرشح في نموذج الفأر المعدل وراثيا (GEM) للسرطان وتحديد تأثير ذلك على نمو الورم. لسوء الحظ ، فإن القضايا التقنية مثل الفتك الجنيني في الضربات القاضية التقليدية والفسيفساء في الضربات القاضية المشروطة غالبا ما تحد من هذا النهج. للتغلب على هذه القيود ، تم تطوير نهج لاستئصال جين قاتل جنيني مفلطخ يهتم بالثقافات قصيرة الأجل لأورام غمد الأعصاب الطرفية الخبيثة (MPNSTs) المتولدة في نموذج GEM.
تصف هذه الورقة كيفية إنشاء نموذج فأر بالنمط الوراثي المناسب ، واشتقاق مزارع الورم قصيرة الأجل من هذه الحيوانات ، ثم القضاء على الجين القاتل الجنيني المفلطح باستخدام ناقل فيروسي غدي يعبر عن Cre recombinase وبروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (eGFP). ثم يتم تفصيل تنقية الخلايا المحولة بالفيروس الغدي باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) وتحديد كمية التأثيرات التي يمارسها الاستئصال الجيني على الانتشار الخلوي ، والجدوى ، و transcriptome ، ونمو allograft التقويمي. توفر هذه المنهجيات نهجا فعالا وقابلا للتعميم لتحديد الأهداف العلاجية والتحقق من صحتها في المختبر وفي الجسم الحي. توفر هذه الأساليب أيضا مصدرا متجددا للخلايا المشتقة من الورم منخفض المرور مع انخفاض في القطع الأثرية للنمو في المختبر . وهذا يسمح بدراسة الدور البيولوجي للجين المستهدف في عمليات بيولوجية متنوعة مثل الهجرة والغزو والانبثاث والتواصل بين الخلايا بوساطة الإخفاق.
Introduction
قبل العقدين الماضيين، كان علاج السرطانات البشرية يعتمد بشكل كبير على العلاج الإشعاعي وعوامل العلاج الكيميائي التي استهدفت على نطاق واسع السكان الخلويين الذين ينتشرون بسرعة عن طريق إتلاف الحمض النووي أو تثبيط تخليق الحمض النووي. على الرغم من أن هذه الأساليب تمنع نمو الخلايا السرطانية ، إلا أنها كانت لها أيضا آثار جانبية ضارة على أنواع الخلايا الطبيعية سريعة التكاثر مثل الخلايا الظهارية المعوية وخلايا بصيلات الشعر. في الآونة الأخيرة ، بدأ علاج السرطان في استخدام عوامل العلاج الكيميائي التي تستهدف بدقة البروتينات ضمن مسارات الإشارات التي تعتبر مهمة للغاية لنمو أورام المريض الفردية. وقد أدى هذا النهج ، الذي يشار إليه عادة باسم “الطب الدقيق” ، إلى تطوير ذخيرة دائمة التوسع من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة والمثبطات الجزيئية الصغيرة. تمنع هذه العوامل بشكل فعال تكاثر الخلايا السرطانية وبقائها مع تجنب الآثار الجانبية الضارة على أنواع الخلايا الطبيعية التي شوهدت مع عوامل العلاج الكيميائي التقليدية والعلاج الإشعاعي. تستهدف الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المستخدمة لعلاج السرطانات البشرية بشكل شائع جزيئات سطح الخلية مثل مستقبلات عامل النمو 1 (على سبيل المثال ، العائلة الكبيرة من كينازات التيروزين المستقبلة التي تمتد عبر الغشاء) ومعدلات الاستجابة المناعية2 (على سبيل المثال ، بروتين موت الخلايا المبرمج 1 ، رباط الموت المبرمج1). يمكن أن تمنع المثبطات الجزيئية الصغيرة إما بروتينات سطح الخلية أو بروتينات الإشارة الموجودة داخل الخلايا3. ومع ذلك ، من أجل توظيف هذه العوامل العلاجية الجديدة بشكل فعال ، يجب إثبات أن سرطانا معينا يعتمد على الجزيء الذي يستهدفه عامل علاجي مرشح.
على الرغم من أن هذه العوامل العلاجية الجديدة لها تأثيرات أكثر تركيزا ، إلا أن العديد منها لا يزال يمنع عمل أكثر من بروتين واحد. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تتوفر عوامل متعددة ذات فعالية وخصوصية متفاوتة لاستهداف بروتين معين. وبالتالي ، أثناء التحقيقات قبل السريرية ، من الحكمة استخدام طرق إضافية مثل الاستئصال الجيني للتحقق من صحة البروتين المرشح كهدف علاجي. أحد الأساليب المفيدة بشكل خاص للتحقق من صحة البروتين كهدف علاجي هو استئصال الجين الذي يشفر البروتين المرشح في نموذج حيواني معدل وراثيا يطور نوع السرطان المحدد للاهتمام. يمكن أن يكون هذا النهج مباشرا نسبيا إذا توفرت الفئران ذات الطفرة الصفرية (إما طفرة طبيعية أو طفرة فارغة معدلة وراثيا [“ضربة قاضية”] أو طفرة فارغة أدخلها مصيدة جينية) ، وكانت الفئران قابلة للحياة في مرحلة البلوغ. لسوء الحظ ، غالبا ما تكون الفئران ذات الطفرة الصفرية التي تلبي هذه المعايير غير متوفرة ، عادة لأن الطفرة الصفرية تؤدي إلى الموت جنينا أو في الأيام الأولى من حياة ما بعد الولادة. في هذه الحالة، يمكن بدلا من ذلك عبور الفئران المعرضة لتطوير نوع الورم محل الاهتمام إلى الفئران التي تحيط بها أجزاء رئيسية من الجين محل الاهتمام بمواقع loxP (“floxed”)، والتي تسمح باستئصال الجين عن طريق إدخال جين متحول يعبر عن Cre recombinase في الخلايا السرطانية (ضربة قاضية مشروطة). يوفر هذا النهج العديد من المزايا. أولا ، إذا كان برنامج تشغيل Cre متاحا يتم التعبير عنه في الورم ولكن ليس في نوع الخلية التي أدت إلى الوفاة في الضربات القاضية التقليدية ، فمن المحتمل أن يؤدي هذا النهج إلى التحقق من صحة الهدف العلاجي المرشح. ثانيا، إن إزالة الجين الذي يشفر البروتين المرشح في الخلايا السرطانية ولكن ليس في العناصر الأخرى داخل الرحم مثل الخلايا الليفية المرتبطة بالورم أو الخلايا المناعية يسمح للباحث بالتمييز بين التأثيرات المستقلة للخلية وغير المستقلة للخلية للهدف العلاجي. وأخيرا، يسمح برنامج تشغيل Cre المستحث بالتاموكسيفين (CreERT2) للباحث بحذف الجين محل الاهتمام في مراحل مختلفة من تطور الورم وتحديد النافذة التي من المرجح أن يكون فيها العامل العلاجي المرشح فعالا.
لسوء الحظ ، هناك أيضا مشكلات فنية يمكن أن تحد من استخدام الضربات القاضية الشرطية في الأورام الناشئة في نماذج GEM. على سبيل المثال ، قد لا يتوفر برنامج تشغيل Cre الذي يتم التعبير عنه في الخلايا السرطانية ويتجنب حذف الجينات في الخلايا الطبيعية الضرورية للحياة. هناك مشكلة أخرى ، والتي يمكن التقليل من شأنها ، وهي أن برامج تشغيل Cre و CreERT2 غالبا ما تقوم باستئصال الأليلات المفلطحة في الفئران ، مما يؤدي إلى الفسيفساء للطفرة الخالية في سرطان GEM. عندما يحدث هذا ، ستستمر الخلايا السرطانية التي لم يتم فيها استئصال الجين المستهدف في التكاثر بسرعة ، مما يؤدي إلى زيادة نمو الخلايا السرطانية مع الأليلات الممزقة. يمكن أن تحدث الفسيفساء في خطوط تشغيل Cre بسبب تعبير Cre غير المنتشر في كل مكان في السلالة المستهدفة وعن طريق إعادة التركيب الفاشلة في الخلايا الفردية المستقلة عن تعبير Cre4. هذه ظاهرة معروفة لبرامج تشغيل Cre تعتمد على نوع الخلية ويجب مراعاتها أثناء التصميم التجريبي وتفسير البيانات. يمكن للفسيفساء أن تخفي تأثير الضربة القاضية وتقود الباحث إلى استنتاج خاطئ بأن الجين محل الاهتمام ليس ضروريا لتكاثر الخلايا السرطانية و / أو البقاء على قيد الحياة ، وبالتالي فهو ليس هدفا علاجيا صالحا.
تمت مواجهة العديد من هذه المشاكل في دراسة سابقة حاولت تحديد ما إذا كان مستقبلات التيروزين كيناز erbB4 هدفا علاجيا محتملا في خلايا MPNST5. في هذه الدراسات ، تم استخدام الفئران التي تعبر عن جين متحول يشفر عامل النمو الدبقي متساوي الشكل neuregulin-1 (NRG1) -β3 (GGFβ3) تحت سيطرة بروتين المايلين الخاص بخلية Schwann صفر المروج (P 0-GGFβ3 الفئران). تطور الفئران P 0-GGFβ3 أورام ليفية عصبية متعددة الشكل تتقدم لتصبح MPNSTs من خلال عملية تلخص عمليات التسبب في الورم العصبي الليفي وتطور الورم الليفي العصبي الضفيري – MPNST الذي شوهد في المرضى الذين يعانون من متلازمة قابلية الورم الجسدي المهيمن الورم العصبي من النوع 1 (NF1)6. عند عبورها إلى الفئران ذات طفرة فارغة Trp53 ، فإن P 0-GGFβ3 الناتجة ؛ Trp53 +/– الفئران تطوير MPNSTs de novo كما هو موضح في cis-Nf1+/-; Trp53+/- الفئران.
تلخص هذه ال MPNSTs التقدم من الصف الثاني لمنظمة الصحة العالمية (WHO) إلى آفات منظمة الصحة العالمية من الدرجة الرابعة التي شوهدت في البشر7. في الفئران P 0-GGFβ3 ، تنشأ MPNSTs داخل الأورام الليفية العصبية الضفيرية الموجودة مسبقا في العصب الثلاثي التوائم (58٪) وجذور العصب الظهري الشوكي (68٪)7 ؛ MPNSTs الناشئة في P 0-GGFβ3 ؛ Trp53 +/- الفئران لديها توزيع مماثل للغاية. في البشر ، تنشأ MPNSTs بشكل شائع في العصب الوركي تليها الضفيرة العضدية ، جذور الأعصاب الشوكية ، المبهمة ، الفخذية ، المتوسطة ، الضفيرة العجزية ، الحاجز المأبضي ، والأعصاب الظنبوبية والزندية الخلفية8. يختلف توزيع الورم هذا في نماذج GEM هذه إلى حد ما عما يشاهد في البشر. ومع ذلك ، فإن MPNSTs التي تنشأ في P 0-GGFβ3 و P0-GGFβ3 ؛ الفئران Trp53 +/- متطابقة من الناحية النسيجية مع MPNSTs البشرية ، وتحمل العديد من الطفرات نفسها التي شوهدت في MPNSTs البشرية ، وتلخص عملية تطور الورم العصبي الليفي – MPNST التي شوهدت في مرضى NF1. توليد P 0-GGFβ3 أو P0-GGFβ3 ؛ Trp53 +/– الفئران التي كانت Erbb4-/- لم تكن مجدية لأن الفئران التي لديها أليلين فارغين من Erbb4 تموت في الرحم في اليوم الجنيني 10.5 الثانوي لعيوب القلب9. لأن إنقاذ تعبير Erbb4 في القلب عن طريق إدخال جين Erbb4 الترانسجين الخاص بالقلب (سلسلة ثقيلة α-myosin (MHC)-Erbb4) ينتج عنه فئران Erbb4-/- قابلة للحياة10 ، جيل الفئران مع P 0-GGFβ3 معقد ؛ Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- تمت محاولة النمط الوراثي.
ومع ذلك ، فإن التزاوج لم ينتج الفئران بالنسب المندلية المتوقعة ، مما يشير إلى أن النمط الوراثي المطلوب كان ضارا. لذلك ، فإن توليد P 0-GGFβ3 ؛ تمت محاولة Trp53 +/- الفئران ذات الأليلات Erbb411 المفلطحة وبرنامج تشغيل CreERT2 للسماح بحذف Erbb4 في MPNSTs الناشئة في هذه الفئران. في هذه الحيوانات ، كانت العديد من الخلايا السرطانية ذات أليلات Erbb4 السليمة لا تزال موجودة (الفسيفساء). يمكن أن تنتج الفسيفساء التي لوحظت عن تسليم تاموكسيفين غير الفعال ، مما أدى إلى اختلافات في كفاءة إعادة التركيب داخل الأنسجة. يمكن أن تسهم إمكانية وجود آليات تعويضية عفوية في زيادة مساهمة الفسيفساء في إعادة التركيب بوساطة تاموكسيفين عن طريق تجاوز شرط التعبير Erbb4. من الممكن أن يؤدي فقدان Trp53 إلى جعل الخلايا السرطانية عرضة لمزيد من الطفرات “المتساهلة” التلقائية التي يمكن أن تربك تفسير البيانات. نظرا لأنه بدا من المحتمل أن تخفي خلايا MPNST السليمة من Erbb4 عواقب إزالة Erbb4 في الخلايا السرطانية الأخرى ، فقد تم التخلي عن هذا النهج.
أدت هذه العقبات إلى تطوير منهجية لاستئصال Erbb4 في خلايا MPNST في وقت مبكر جدا باستخدام فيروس غدي يعبر عن Cre recombinase و eGFP. يمكن فصل هذه الخلايا عن الخلايا غير المصابة باستخدام FACS، مما يقلل بشكل ملحوظ من الفسيفساء لجين Erbb4 الذي تم إزالته. أدناه ، يتم وصف الطرق المستخدمة لتحقيق ذلك ، جنبا إلى جنب مع الطرق المستخدمة لتقييم آثار الاستئصال الجيني في المختبر وفي الجسم الحي. البروتوكول التالي هو مثال على كيفية إنتاج الفئران الحاملة للورم التي تنتج أورام تحمل أليلات مفلطخة من الجينات القاتلة الجنينية ذات الأهمية لاستئصال خارج الجسم الحي قبل تقييم نمو الورم في الجسم الحي . يتضمن ذلك وصفا للنهج المستخدمة لتحليل التأثير الذي يمارسه استئصال Erbb4 على انتشار الخلايا السرطانية ، والبقاء على قيد الحياة ، والتعبير الجيني في المختبر والانتشار ، والبقاء على قيد الحياة ، وتكوين الأوعية الدموية في اللوغاريتات التقويمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تطوير الطرق التفصيلية المعروضة هنا باستخدام نموذج GEM من MPNSTs. ومع ذلك ، إذا كان من الممكن تشتيت أنسجة الورم ذات الأهمية إلى خلايا فردية ، فإن هذه المنهجيات قابلة للتكيف بسهولة مع أنواع الأورام المختلفة الناشئة في GEMs. من المهم التأكد من أن الأليل المفلطح لا يؤدي إلى i) انخفاض البقاء على قيد …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح من المعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية (R01 NS048353 ، R01 NS109655) ، والمعهد الوطني للسرطان (R01 CA122804) ، ووزارة الدفاع (X81XWH-09-1-0086 ، W81XWH-11-1-0498 ، W81XWH-12-1-0164 ، W81XWH-14-1-0073 ، و W81XWH-15-1-0193) ، ومؤسسة أورام الأطفال (2014-04-001 و 2015-05-007).
Materials
| Ad5CMV-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-4 | |
| Ad5CMVCre-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-1174 | |
| alexa 568 secondary antibody | Thermo/Fisher | GaR A11036 | |
| Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics | Bioconductor | http://www.bioconductor.org | alternative statistical analysis tool used for step 4.4 |
| CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom Bioscience | N/A | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-Cl | mixture of chelators |
| DAB staining kit | Vector Labs | MP-7800 | |
| DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) | DAVID | https://david.ncifcrf.gov | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| DMEM | Corning | 15-013-Cl | |
| DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR) | Thermo/Fisher | EP0701 and K1072 | |
| erbB4 antibodies | Santa Cruz | sc-284 | |
| erbB4 antibodies | Abcam | ab35374 | |
| erbB4 antibodies | Millipore | HFR1: 05-1133 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | Aria II | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| GenomeSpace Tools and Data Sources | GenomeSpace | https://genomespace.org/support/tools/ | general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5 |
| Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
| Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool | Gorilla | N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| GSEA Gene Set Enrichment Analysis | Broad Institute | N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice | Envigo (Previously Harlan Labs) | 69 | |
| Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer) | Illumina | Hi Seq 2500 | DNA sequencer used for step 4.2 |
| Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis | DNAStar LaserGene software | N/A | software statistical and normalization analysis used for step 4.4 |
| Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly | software alignment used for step 4.3 | N/A | software alignment used for step 4.3 |
| Matrigel, low growth factor basement membrane matrix | Corning | 354230 | |
| NRG1-beta | In house | Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF). | |
| Nuclear Stain Hoeschst 33342 | Thermo | 62249 | |
| Panther Gene Ontology Classification System | Panther | http://pantherdb.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| Partek (BWA aligner and analyzer) | Partek, Ver 7 | N/A | software alignment and statistical/normalization used for step 4.3 |
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
| Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
|
Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product. | |
| Propidium Iodine | Fisher | 51-351-0 | |
| Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays | R&D Systems | ARY003B | |
| Real time glo | Promega | G9712 | bioluminescent cell viability assay |
| ToppGene Suite | ToppGene | https://toppgene.cchmc.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent) | Invitrogen | 15596026 | |
| Tyramide Signal Amplification Kit | Perkin Elmer | NEL721001EA |
References
- Ricciuti, B., et al. Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology. Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).
- Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347 (2019).
- Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors. Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).
- Heffner, C. S., et al. Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource. Nature Communications. 3, 1218 (2012).
- Longo, J. F., et al. ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).
- Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
- Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).
- Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases. Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).
- Gassmann, M., et al. Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor. Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).
- Tidcombe, H., et al. Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).
- Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse. Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).
- Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
- Jackson-Fisher, A. J., et al. Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4. Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).
- Byer, S. J., et al. Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner. Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).
- Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma. Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).
- Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).
- Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells. Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).
- Kaur, S., et al. CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs. Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).
- Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Lin, Y., et al. Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 17, 28 (2016).
- Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
- Huang, D. W., et al. The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists. Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).
- Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
- Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation. PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).
- Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates. PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).
- Koch, C. M., et al. A beginner’s guide to analysis of RNA sequencing data. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).
- Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).
- Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).
- Chen, Z., et al. Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma. Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).
- Mo, J., et al. Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).
- Chau, V., et al. Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors. Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).
- Dodd, R. D., et al. NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response. Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).
- Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).
